면역글로불린 G(IgG) N-글리칸은 친수성 상호작용 UPLC를 사용하는 것을 특징으로 한다. 또한, IgG N-글리칸의 구조는 명확하게 분리된다. 여기에 제시된 이 실험 방법에 대한 소개는 연구 환경에서 널리 사용될 수 있도록 한다.
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방법 논문
초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 면역글로불린 G N-글리칸 분석
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
글리코믹스는 오믹스 시스템 연구의 새로운 특수 분야로, 질병 감수성, 약물 표적 발견 및 정밀 의학을 위한 차세대 바이오마커 를 발견하는 데 상당한 잠재력을 제공합니다. 대안 IgG N-glycans는 몇몇 일반적인 만성 질병에서 보고되고 임상 응용 (즉, 질병의 진단 및 예측을 위한 바이오마커)에 있는 중대한 잠재력을 가지고 제안되었습니다. IgG N-글리칸널리 친수성 상호 작용 크로마토그래피 (HILIC) 초고성능 액체 크로마토그래피 (UPLC)의 방법을 사용하여 특징지어진다. UPLC는 재현성이 뛰어나고 상대적 정량이 높은 안정적인 검출 기술입니다. 또한, IgG N-glycan의 구조는 명확하게 분리되고, 혈장내의 글리칸 조성및 상대적 풍부도가 특징지어진다.
서론
인간단백질의 N-글리코실화는 일반적이고 필수적인 번역 후 변형1이며 질병의 발생 및 발병을 비교적 정확하게 예측하는 데 도움이 될 수 있다. 그 구조의 복잡성으로 인해 5,000 개 이상의 글리칸 구조가 있을 것으로 예상되며, 질병에 대한 진단 및 예측 바이오 마커로서 큰 잠재력을 제공합니다2. 면역글로불린 G(IgG)에 부착된 N-글리칸들은 IgG의 기능에 필수적인 것으로 나타났으며, IgG N-glycosylation은 프로-및 항염증 시스템 사이의 균형에 참여한다3. 차동 IgG N-glycosylation은 질병 병리학에 관여하는 소인 및 기능적 메커니즘을 모두 나타내는 질병 발달 및 진행에 관여한다. IgG N-glycosylation의 염증성 역할은 노화, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 암4와관련이 있다.
감지 기술의 개발과 함께, 형광 검출 (UPLC-FLR) 친수성 상호 작용 크로마토그래피 (HILIC) 초고성능 액체 크로마토그래피, 레이저 유도 형광을 이용한 멀티플렉스 모....
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프로토콜
이 의정서에 포함된 모든 과목은 중국 베이징 의과대학의 윤리위원회의 승인을 받았습니다12. 서면 동의는 연구의 시작 부분에 각 과목에서 얻은.
1. IgG 격리
- 결합 완충제 (인산완충식염수, PBS): 1x PBS (pH = 7.4), 중화 버퍼 : 10x PBS (pH = 6.6-6.8), 용리액 : 0.1 M 포름산 (pH = 2.5), 용리액용 중화 액: 1 M 암모늄 중탄산염, 저장 버퍼 를 포함한 화학 물질을 준비하십시오. 에탄올 + 20 mM 트리스 + 0.1 M NaCl (pH = 7.4), 단백질 G용 세정 용액 : 0.1 M NaOH + 30 % 프로판 -2-올.
참고: 이 프로토콜에서는 pH 수준이 매우 중요합니다. IgG의 용출은 매우 낮은 pH를 필요로하며, 산 가수 분해로 인한 시실산의 손실 위험이 있다. 따라서 용출은 몇 초 내에 발생하고 pH는 IgG 및 시실산의 무결성을 보존하여 중성으로 신속하게 복원됩니다. - 시료 를 준비 : 냉동 플라즈마 샘플을 해동 한 다음 10 분 동안 80 x g에서 원심 분리를 하고, 실온 (RT)에서 30 분 동안 단백질 G 모놀리식 플레이트와 상기 화학 물질을 둡니다.
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결과
도 1에나타낸 바와 같이, IgG N-글리칸스는 피크 위치 및 유지 시간에 기초하여 24개의 초기 IgG 글리칸 피크(GPs)로 분석되었다. N-글리칸구조는 이전 연구(표1)15에따른 질량 분석 검출을 통해 사용할 수 있다. 결과를 비교하기 위해, 각 피크의 글리칸 양을 총 통합 영역의 백분율로 표현한 총 면적 정규화가 적용되었습니다.
방법의 반복성 및 안정성을 평가하기 위해, 표준 샘플을 6회 병렬로 시험하였다. 표 2에나타낸 바와 같이, 24GPs의 변동계수(CV)는 1.84%-16.73%, 15(62.50%)의 범위범위 그 중 10% 미만이었습니다. 상대적으로 작은 비율.......
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토론
UPLC는 상대정량분석방법5,15. 결과는 UPLC가 좋은 재현성과 상대적인 정량적 정확도를 갖춘 안정적인 검출 기술임을 나타냅니다. 각 피크의 글리칸 양은 상대값인 UPLC를 사용하여 총 통합 영역의 백분율로 표현됩니다. 상대 정량화는 시험 샘플의 비교 가능성을 향상시킵니다. 또한, 96웰 프로틴 G 플레이트는 높은 처리량 검출을 위해 한 번에 96개의 샘플로 IgG를 정화하는 데 사용됩니다. IgG를 결합하는 단백질 G의 능력은 이전 연구15,16에기재된 바와 같이 단백질 A보다 크다.
또한, IgG N-글리칸의 구조는 명확하게 분리된다. 유래 IgG 글리칸은 초기 IgG N-글리칸에 의해 계산되는 갈락토실화, 시알릴레이션, 이등분 GlcNAc
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81673247 및 81872682)과 호주 - 중국 협력 보조금 (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020)의 보조금으로 지원되었습니다.
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재료
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| 96-웰 필터 플레이트 | Pol | 0.45 um GHP | |
| 96-웰 모놀리식 플레이트 | BIA 분리 | ||
| 96-웰 플레이트 로터 | Eppendorf Co., Ltd, 독일 | T_1087461900 | |
| 아세트산 | 시그마, 중국 | ||
| Acetonitrile | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, 중국 | ||
| Ammonium bicarbonate | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, 중국 | ||
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| 계량 저울 | Shanghai Jingke Scientific Instruments Co., Ltd. | MP200B |
참고문헌
- Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 214(2012).
- Cummings, R., Pierce, J. M. The Challenge and Promise of Glycomics. Chemistry Biology. 21 (1), (2014).
- Shade, K. T.....
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