In Vivo Bewertung der Alveolar Makrophagen-Efferozytose nach Ozon-Exposition

Summary

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Bestimmung, ob die Exposition gegenüber Ozon, einem Kriterium des Luftschadstoffs, die Alveolarmakrophagen-Efferozytose in vivo beeinträchtigt. Dieses Protokoll verwendet häufig verwendete Reagenzien und Techniken und kann an mehrere Modelle von Lungenverletzungen angepasst werden, um Die Auswirkungen auf die Alveolar-Makrophagen-Efferozytose zu bestimmen.

Abstract

Ozon (O₃) ist ein Kriterium Luftschadstoff, das die Inzidenz von chronischen Lungenerkrankungen verschlimmert und erhöht. O₃ Exposition ist bekannt, lungenentzündung zu induzieren, aber wenig ist darüber bekannt, wie Exposition verändert Prozesse wichtig für die Auflösung von Entzündungen. Efferozytose ist ein Auflösungsprozess, bei dem Makrophagen apoptotische Zellen phagozytisieren. Der Zweck dieses Protokolls ist es, alveolare Makrophagen-Efferozytose nach_{O3-induzierten}Lungenverletzungen und Entzündungen zu messen. Zur Messung der Efferozytose wurden mehrere Methoden beschrieben; die meisten erfordern jedoch Ex-vivo-Manipulationen. Beschrieben im Detail hier ist ein Protokoll zur Messung in vivo alveolar Makrophagen-Efferozytose 24 h nach O_{3-Exposition,} die Ex-vivo-Manipulation von Makrophagen vermeidet und als einfache Technik dient, die verwendet werden kann, um Störungen in Auflösungsprozess. Das Protokoll ist eine technisch nicht-intensive und relativ kostengünstige Methode, die eine Ganzkörper-O3-Inhalation, gefolgt von oropharyngealer Aspiration von apoptotischen Zellen (d. h. Jurkat-T-Zellen) unter Vollnarkose beinhaltet. Die Alveolar-Makrophagen-Efferozytose wird dann durch Lichtmikroskopie auswertung von Makrophagen gemessen, die aus Bronchoalveolar (BAL) Lavage gesammelt wurden. Die Efferozytose wird schließlich durch die Berechnung eines efferozytischen Indexes gemessen. Zusammen quantifizieren die skizzierten Methoden die efferozytische Aktivität in der Lunge in vivo und dienen gleichzeitig der Analyse der negativen gesundheitlichen Auswirkungen von O₃ oder anderen inhalierten Beleidigungen.

Introduction

Die Lunge ist ständig Umweltbeleidigungen ausgesetzt, einschließlich Luftpartikeln, Viren, Bakterien und oxidativen Gasen, die^{Lungenentzündungen}auslösen 1^,2,3. Diese Beleidigungen können den Gasaustausch gefährden und irreversible Gewebeverletzungen induzieren^4,5. Alveolar-Makrophagen, die etwa 95% der Immunzellen in murinen und menschlichen Lungen bei Homöostase ausmachen, sind kritische Regulatoren der Lungenentzündung nach Umweltbeleidigungen^{1,2, 3,4,5}. Alveolar Makrophagen sind während der Wirtsabwehr durch Phagozytisierung und Eliminierung von Krankheitserregern unerlässlich. Kürzlich, Alveolar Makrophagen haben gezeigt, gewebeHomöostase und die Auflösung von Entzündungen durch Efferozytose zu fördern^6,7. Efferozytose ist ein phagozytischer Prozess, bei dem Makrophagen apoptotische Zellen^8,9,10verschlingen und eliminieren. Die Efferozytose führt auch zur Herstellung von Mediatoren (d.h. IL-10, TGF-, PGE₂und Stickstoffmonoxid), die den Prozess weiter verstärken, was zur Auflösung von Entzündungen^{9,10,11 ,12,16,18}. Dieser Prozess ist notwendig, um sekundäre Nekrose zu verhindern und Gewebehomöostase zu fördern^12,13,14. Mehrere Studien haben eine beeinträchtigte Efferozytose mit verschiedenen chronischen Lungenerkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankungen und idiopathische Lungenfibrose^{8,9,15, 16,17}.

O₃ ist ein Kriterium Luftschadstoff, der die Inzidenz von chronischen Lungenerkrankungen verschlimmert und erhöht^19,20,21. O₃ induziert Lungenentzündung und -verletzung und ist dafür bekannt, alveolare Makrophagenphagozytose von bakteriellen Erregern zu beeinträchtigen^22,23. Es ist jedoch nicht bekannt, ob_O3 die Alveolarmakrophagen-Efferozytose beeinträchtigt. Die Untersuchung von_{O3-induzierten}Veränderungen bei der Alveolarmakrophagen-Efferozytose wird potenzielle Einblicke in die Frage liefern, wie eine Exposition zu chronischer Inzidenz von Lungenerkrankungen und Verschlimmerung führen kann. Im Folgenden beschrieben ist eine einfache Methode zur Bewertung der alveolären Makrophagen-Efferozytose in der Lunge weiblicher Mäuse nach akuter_{O3-Exposition.}

Die skizzierte Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Efferozytoseprotokollen, die häufig im Feld verwendet werden, indem kostspielige Fluoreszenzfarbstoffe, umfangreiche Durchflusszytometriemessungen und Ex-vivo-Manipulationen von Alveolarmakrophagen eliminiert werden^{24 ,25}. Darüber hinaus misst dieses Protokoll die Alveolarmakrophagen-Efferozytose im Kontext der Lungenmikroumgebung, die die Makrophagenfunktion beeinflussen kann.

Protocol

Alle Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der East Carolina University genehmigt. 1. Ozon (O3) und gefilterte Luftexpositionen (Tag 1) Legen Sie maximal 12 weibliche C57BL/6J-Mäuse, 8-12 Wochen alt, in einen Stahlkäfig (mit 12 separaten Fächern) mit Drahtgitterdeckeln in eine O 3-Belichtungskammer. Legen Sie das Thermometer in die Belichtungskammer mit dem Käfig, um die Temperatur und Luftfeuchtigkeit genau aufzuz…

Representative Results

O3 Exposition ist bekannt, Lungenentzündung und Verletzungen zu induzieren, und Efferozytose ist erforderlich, um Gewebe Homöostase zu erhalten. C57BL/6J weibliche Mäuse wurden gefilterter Luft (FA) oder 1 ppm O3 für 3 h und necropsied 24 h nach der Exposition ausgesetzt, um Lungenentzündungen und Verletzungen zu untersuchen. O3-exponierte Mäuse zeigten im Vergleich zur FA-Kontrollgruppe einen signifikanten Anstieg der Makrophagen und Neutrophilen im Luftraum (…

Discussion

Efferozytose ist ein entzündungshemmender Prozess, bei dem Makrophagen apoptotische Zellen und Ablagerungen reinigen sowie mehrere entzündungshemmende^Mediatoren9^{,10,11,12,16 produzieren ,18}. Mehrere Modelle der Efferozytose haben Einen Einblick gegeben, wie das Makrophagen eine kritische Zelle in der Auflösung von Entzün…

Materials

Annexin V-FITC Kit	Trevigen	4830-250-K	The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells	ATCC	ATCC CRL-2899	The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis.
Countess II Automated Cell Counter	Thermofisher	AMQAX1000	It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermofisher	A78300003	Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated	Thermofisher	16140071	Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture.
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin	Thermofisher	9990706	Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative	Thermofisher	9990705	Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue	Thermofisher	9990707	Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin	Sigma/Aldrich	P0781-100ML	Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermofisher	61870036	RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker	Cambridge Scientific	16659	The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer	Teledyne API	T400	The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator	Teledyne API	T703	Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.