בהערכת Vivo של מכתשי מקרופאג Efferocytosis בעקבות חשיפת האוזון
Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול לקביעת האם חשיפה לאוזון, קריטריון מזהם אוויר, פוגע מכתשי מקרופאג efferocytosis בvivo. פרוטוקול זה מנצל בדרך כלל ריאגנטים וטכניקות והוא יכול להיות מותאם מודלים מרובים של פגיעה בריאות כדי לקבוע את ההשפעות על מכתשי מקרופאג efferocytosis.
Abstract
אוזון (O3) הוא קריטריון מזהם אוויר המגדילה ומגביר את השכיחות של מחלות ריאות כרוניות. O3 חשיפה ידוע לגרום לדלקת בריאות, אבל מעט ידוע לגבי איך חשיפה משנה תהליכים חשובים הרזולוציה של דלקת. Efferocytosis הוא תהליך החלטה, לפיו מקרופאגים מפאגים בתאי האפוטוטיים. המטרה של פרוטוקול זה היא למדוד מכתשי מקרופאג efferocytosis בעקבות המושרה הנגרמת פציעה ריאה ודלקת. מספר שיטות תוארו עבור מדידת efferocytosis; עם זאת, רוב דורשים מניפולציות vivo ex. מתוארים בפירוט כאן הוא פרוטוקול למדוד vivo מכתשי מקרופאג efferocytosis 24 שעות אחרי החשיפה O3 , אשר נמנעת מניפולציה vivo ex של מקרופאגים ומשמש כטכניקה פשוטה שניתן להשתמש בו כדי לייצג במדויק רטבאליות תהליך החלטה זה. הפרוטוקול הוא שיטה מבחינה טכנית שאינה אינטנסיבית וזולה יחסית המערבת שאיפת גוף שלם3 ולאחריה שאיפה לוע של תאים אפוטוטיים (כלומר, התאים של ג’ורקאט T) תוך כדי הרדמה כללית. מכתשיים מקרופאג efferocytosis נמדד לאחר מכן על ידי הערכת מיקרוסקופ אור של מקרופאגים שנאספו מתוך ברונשיים (BAL) ששטיפה. Efferocytosis נמדד לבסוף על-ידי חישוב אינדקס efferocytic. באופן קולקטיבי, שיטות מיתאר לכמת פעילות efferocytic בריאה ב vivo תוך שהיא משרתת גם לנתח את ההשפעות הבריאותיות השליליות של O3 או עלבונות אחרים שאפו.
Introduction
הריאה נחשפת כל הזמן לעלבונות סביבתיים, כולל חלקיקים אוויריים, וירוסים, חיידקים, וגזים חמצון המפעילות דלקת ריאות1,2,3. העלבונות האלה יכולים להתפשר על החלפת גזולגרום לפציעה הרקמהבלתי הפיכה 4,5. מכתשי מקרופאגים, המהווים כ 95% של התאים החיסוניים נמצא מורנה והריאות האנושית ב הומאוסטזיס, הם הרגולטורים קריטיים של דלקת ריאות לאחר עלבונות סביבתיים1,2, .שלוש,ארבע,חמש מקרופאגים מכתשיים חיוניים במהלך ההגנה המארחת על ידי phagocytizing וסילוק פתוגנים. לאחרונה, מכתשי מקרופאגים הוכחו לקדם את הומאוסטזיס רקמות ואת הרזולוציה של דלקת דרך efferocytosis6,7. Efferocytosis הוא תהליך phagocytic שבו מקרופאגים המפרץ לחסל תאים אפוטוטיים8,9,10. Efferocytosis גם תוצאות ייצור של מגשרים (כלומר, IL-10, tgf-β, pge2, ו תחמוצת החנקן) כי עוד להגדיל את התהליך, וכתוצאה מכך הרזולוציה של דלקת9,10,11 ,12,16,18. תהליך זה הכרחי למניעת נמק משני וקידום הומאוסטזיס הרקמות12,13,14. מספר מחקרים המקושרים efferocytosis לקוי עם מחלות ריאה כרוניות שונות, כולל אסטמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית, ו פיברוזיס ריאות אידיופטית8,9,15, 16,17.
O3 הוא קריטריון מזהם אוויר כי מגביר בייטס ומגדיל את השכיחות של מחלות ריאות כרוניות19,20,21. O3 מעורר דלקת הריאות פציעה והוא ידוע לפגוע מכתשי מקרופאג phagocyציטוזה של פתוגנים חיידקיים22,23. עם זאת, זה לא ידוע אם3 או 2 פוגע מכתשי מקרופאג efferocytosis. חקירת O3שינויים המושרה ב מכתשי מקרופאג efferocytosis יספק תובנה פוטנציאלית לתוך כמה חשיפה יכולה להוביל לשכיחות מחלת הריאות כרונית והחרפה. המתואר להלן היא שיטה פשוטה להערכת מכתשי מקרופאג efferocytosis בריאות של עכברים נקבה לאחר החשיפה החדה O3 .
השיטה מחולקת על מספר יתרונות על פני פרוטוקולים efferocytosis אחרים בשימוש נפוץ בתחום על-ידי ביטול השימוש של צבעי פלורסנט יקר, מדידות הזרימה הנרחבת cy, ולשעבר vivo מניפולציה של מכתשי מקרופאגים24 ,25. בנוסף, פרוטוקול זה מודד מכתשיים מקרופאג efferocytosis בהקשר של מיקרו הסביבה הריאה, אשר יכול להשפיע על מקרופאג פונקציה.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efferocytosis הוא תהליך אנטי דלקתי שבו מקרופאגים ברורים תאים ופסולת ברור כמו גם לייצר מגשרים אנטי דלקתיות מרובים9,10,11,12,16 ,18. מודלים מרובים של efferocytosis סיפקו תובנה כיצד מקרופאג הוא תא קריטי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה ממומן על ידי המכון לאפקטים בריאותיים וולטר א. רוזנבליט ו-הR01ES028829 (ק. מ. ג). אנו רוצים להודות לד ר דיאן וולטרס (המחלקה לפיזיולוגיה, ECU) על עזרתה בהשגת תמונות מייצגות של מקרופאגים מכתשיים.
Materials
| Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
| BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
| Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
| Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
| Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
| Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
| Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
| Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |
References
- Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung. Immunology and Cell Biology. , (2019).
- Gregoire, M., et al. Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS. European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).
- Fan, E. K. Y., Fan, J. Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation. Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).
- Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).
- Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).
- Donnelly, L. E., Barnes, P. J. Defective phagocytosis in airways disease. Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).
- Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients. Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).
- Vandivier, R. W., et al. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).
- Grabiec, A. M., et al. Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).
- Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).
- Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis. Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).
- O’Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats. Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).
- Shen, Z. X., et al. Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis. Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hamon, R., et al. Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function. Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).
- Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization. European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).
- Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).
- Brouckaert, G., et al. Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).
- Gonzalez-Guevara, E., et al. Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas. Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).
- Robertson, S., et al. CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure. Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).
- Kilburg-Basnyat, B., et al. Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation. Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).
- Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. The effects of ozone on immune function. Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).
- Tao, H., et al. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).
- Coe, L. M., et al. FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).
- Yong, W. K., Abd Malek, S. N. Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).
- Van de Laar, L., et al. Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages. Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).
- Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
- Beattie, L., et al. Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions. Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. , (2019).
- Crowther, J. E., et al. Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity. Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).
- Silveyra, P., Floros, J. Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury. Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).
- Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils. Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Nebbioso, A., et al. Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses. Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).
- Novak, Z., et al. Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).
- Park, Y. J., et al. PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).
- Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).
- Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).
