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면역학 및 감염병학

オゾン暴露後の肺胞マクロファージエフェロサイトーシスの生体内評価

Published: October 22, 2019
doi:
10.3791/60109
, , ,
1Department of Pharmacology and Toxicology,East Carolina University, 2Research Triangle Park,National Institute of Environmental Health and Sciences

Summary

この原稿は、大気汚染物質であるオゾンへの曝露が生体内の肺胞マクロファージエフェロサイト症を損なうかどうかを決定するためのプロトコルを記述する。このプロトコルは、一般的に使用される試薬および技術を利用し、肺胞マクロファージエフェロサイトシスへの影響を決定するために肺損傷の複数のモデルに適応することができる。

Abstract

オゾン(O3)は、慢性肺疾患の発生率を悪化させ、増加させる基準である。O3暴露は肺炎症を誘発することが知られているが、暴露が炎症の解決に重要なプロセスをどのように変化させるかについてはほとんど知られていない。エフェロサイト症は、マクロファージがアポトーシス細胞を食細胞化する分解能プロセスである。このプロトコルの目的は、O3誘発性肺損傷および炎症に続く肺胞マクロファージエフェロサイト症を測定することである。エフェロサイトアシスを測定するためのいくつかの方法が記載されています。ただし、ほとんどの場合、ex vivo 操作が必要です。ここでは詳細に説明するO3暴露後の生体内肺胞マクロファージエフェロサイトシス24hで測定するプロトコルであり、マクロファージの排外操作を回避し、摂動を正確に表現するために使用できる簡単な技術として機能する。この解決プロセス。このプロトコルは、全身O3吸入に続いて、全身麻酔下でアポトーシス細胞(すなわち、Jurkat T細胞)の口腔咽頭吸引を伴う技術的に非集中的で比較的安価な方法である。次いで、気管支アルフェオール(BAL)洗浄剤から採取したマクロファージの光顕微鏡検査評価により、肺胞マクロファージエフェロサイト症を測定する。エフェロサイトシスは、最終的に発泡性指数を計算することによって測定される。概説された方法は、生体内の肺における発泡性活性を定量化する一方で、O3または他の吸入された侮辱の負の健康影響を分析するのに役立つ。

Introduction

肺は常に肺の炎症を引き起こす空気微粒子、ウイルス、細菌、および酸化性ガスを含む環境侮辱にさらされている1、2、3。これらの侮辱は、ガス交換を危険にさらし、不可逆的な組織損傷4、5を誘発することができます。恒常性におけるマウスおよびヒト肺に見られる免疫細胞の約95%を構成する肺胞マクロファージは、環境侮辱1、2後の肺炎症の重要な調節薬である。3,4,5.肺胞マクロファージは、病原体を食器化および排除することにより宿主防御中に不可欠である。最近、肺胞マクロファージは、組織恒常性および発泡細胞症6、7を介した炎症の解決を促進することが示されている。エフェロサイト症は、マクロファージがアポトーシス細胞8、9、10を巻き込み、排除する食細胞プロセスである。エフェロサイトーシスはまた、プロセスをさらに増強するメディエーター(すなわち、IL-10、TGF-β、PGE2、および一酸化窒素)の産生をもたらし、炎症9、10、11の解決をもたらす ,12,16,18.このプロセスは、二次壊死を予防し、組織恒常性を促進するために必要です12,13,14.いくつかの研究は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、および特発性肺線維症8、9、15を含む様々な慢性肺疾患と損なわれた肺細胞症をリンクしています。 16、17.

O3は、慢性肺疾患19、20、21の発生率を悪化させ、増加させる基準大気汚染物質である。O3は肺炎症および損傷を誘発し、細菌病原体22,23の肺胞マクロファージ性細胞症を損なう知られている。しかし、O3が肺胞マクロファージエフェロサイトーシスを損なうかどうかは不明である。O3-誘導性の肺マクロファージエフェロサイトーシスの改変を調べると、暴露が慢性肺疾患の発生率および悪化につながる方法についての潜在的な洞察を提供する。以下に説明する急性O3曝露後の雌マウスの肺における肺胞マクロファージエフェロサイト症を評価する簡単な方法である。

概説された方法は、高価な蛍光色素、広範なフローサイトメトリー測定、および肺胞マクロファージ24の外生操作の使用を排除することにより、この分野で一般的に使用される他のエフェロサイトーシスプロトコルに対していくつかの利点を有する。 、25.さらに、このプロトコルは、マクロファージ機能に影響を与える可能性のある肺微小環境のコンテキストで肺胞マクロファージエフェロサイトシスを測定します。

Protocol

すべての方法は、イーストカロライナ大学の機関動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。 1. オゾン(O3)とろ過空気暴露(1日目) 最大12匹のメスC57BL/6Jマウス(生後8~12週齢)を、金網蓋付きのスチールケージ(12個の別々のコンパートメント付き)に入れ、O3露光室に入れます。 温度と湿度を正確に記録するために、ケージと露出室に…

Representative Results

O3暴露は肺の炎症および傷害を誘発することが知られており、組織恒常性を維持するためにはエフェロサイトーシスが必要である。C57BL/6J雌マウスを濾過空気(FA)または1ppmO3を3時間曝露し、24時間曝露後に肺炎症および損傷を調べた。O3-露出マウスは、FA対照群と比較して空域におけるマクロファージおよび好中球の有意な増加を示した(<strong cla…

Discussion

エフェロサイトーシスは、マクロファージがアポトーシス細胞や破片をクリアし、複数の抗炎症メディエーター9、10、11、12、16を産生する抗炎症プロセスです。 、18.エフェロサイトシスの複数のモデルは、マクロファージが炎症6?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、健康効果研究所ウォルターA.ローゼンブリス賞とNIEHS R01ES028829(K.M.Gに)によって資金提供されています。肺胞マクロファージの代表的な画像を得る支援をいただいたダイアン・ウォルターズ博士(ECU生理学科)に感謝します。

Materials

Annexin V-FITC Kit Trevigen 4830-250-K  The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells  ATCC ATCC CRL-2899 The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. 
Countess II Automated Cell Counter Thermofisher AMQAX1000 It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher A78300003 Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Thermofisher 16140071 Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. 
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin Thermofisher 9990706 Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative Thermofisher 9990705 Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue Thermofisher 9990707 Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin Sigma/Aldrich P0781-100ML Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermofisher 61870036 RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker Cambridge Scientific  16659 The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer  Teledyne API T400 The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator Teledyne API T703 Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.
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Keywords: Alveolar MacrophageEfferocytosisOzone ExposureLung InjuryInflammationJurkat T CellsApoptotic CellsUV IrradiationCell CultureIn Vivo Assessment
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Hodge, M. X., Reece, S. W., Madenspacher, J. H., Gowdy, K. M. In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (152), e60109, doi:10.3791/60109 (2019).
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