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Abstract
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면역학 및 감염병학

오존 노출 에 따른 폐포 대식세포 비세포증의 생체내 평가

Published: October 22, 2019
doi:
10.3791/60109
, , ,
1Department of Pharmacology and Toxicology,East Carolina University, 2Research Triangle Park,National Institute of Environmental Health and Sciences

Summary

이 원고는 오존에 노출 여부를 결정하기위한 프로토콜을 설명, 기준 대기 오염 물질, 생체 내에서 폐포 대식세포 efferocysis를 손상. 이 프로토콜은 일반적으로 사용되는 시약 및 기술을 활용하고 폐 포상 손상의 여러 모델에 적응하여 폐포 대식세포 효능에 미치는 영향을 결정할 수 있습니다.

Abstract

오존(O3)은 만성 폐질환의 발생률을 악화시키고 증가시키는 대기오염물질이다. O3 노출은 폐 염증을 유도하는 것으로 알려져 있지만, 노출이 염증의 분해에 중요한 과정을 변경하는 방법에 관해서는 거의 알려져 있다. Efferocytosis는 대식세포가 세포 사멸 세포를 세포세포화하는 분해 과정입니다. 이 프로토콜의 목적은O3-유도폐손상 및 염증에 따른 폐포 대식세포 효능을 측정하는 것이다. 몇몇 방법은 efferocytosis를 측정하기 위한 기술되었습니다; 그러나, 대부분은 ex vivo 조작을 요구합니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜은O3 노출 후 생체 내 폐포 대식세포 증 24시간 동안 측정되는 프로토콜로, 이는 대식세포의 생체 내 조작을 피하고 교란을 정확하게 나타내는 데 사용될 수 있는 간단한 기술로 작용한다. 이 해결 프로세스를 참조하십시오. 이 프로토콜은 전신 마취 하에 전신 세포(즉, Jurkat T 세포)의 구인두 포인션에 이어 전신O3 흡입을 수반하는 기술적으로 비집약적이고 비교적 저렴한 방법입니다. 폐포 대식세포 efferocytosis는 기관지 veaolar (BAL) 세척에서 집합된 대식세포의 빛 현미경 평가에 의해 그 때 측정됩니다. Efferocytosis는 마지막으로 efferocytic 지수를 계산하 여 측정됩니다. 집합된 방법은 생체 내 폐에서 의 한 세포 활성을 정량화하는 동시에O3 또는 다른 흡입 된 모욕의 부정적인 건강 효과를 분석하는 역할을합니다.

Introduction

폐는 폐염증을 유발하는 공기미립자, 바이러스, 세균 및 산화제 가스를 포함한 환경적모욕에지속적으로 노출된다1,2,3. 이러한 모욕은 가스 교환을 손상시키고 돌이킬 수없는 조직 손상을 유발할 수 있습니다4,5. 항상성에서 뮤린과 인간 폐에서 발견되는 면역 세포의 약 95%를 구성하는 폐포 대식세포는 환경 적 폐 후 폐 염증의 중요한조절제1,2, 3,4,5. 폐포 대식세포는 병원균을 식세포화하고 제거함으로써 숙주 방어 중에 필수적입니다. 최근에는 폐포 대식세포가 조직 항상성 및 효능 을 통한 염증의 분해를 촉진하는 것으로 나타났다6,7. Efferocytosis는 대식세포가 세포 사멸 세포를 삼키고 제거하는 식세포 과정입니다8,9,10. Efferocytosis는 또한 염증의 분해의 결과로, 더 과정을 증가 시키는 중재제 (즉, IL-10, TGF-β, PGE2,및 산화 질소)의 생산을 초래합니다9,10, 11 ,12,16,18. 이 과정은 이차 괴사를 예방하고 조직 항상성을 촉진하는 데 필요합니다12,13,14. 여러 연구는 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 특발성 폐 섬유증8,9,15,등 다양한 만성 폐 질환과 손상된 성비세포증을 연결한 적이 있다. 16,17.

O3는 만성폐질환의 발생률을 악화시키고 증가시키는 대기오염물질19,20,21이다. O3는 폐염증 및 상해를 유발하고 세균성 병원균의 폐포 대식세포 식균증을 손상시키는 것으로 알려져 있다22,23. 그러나, O3이 폐포 대식세포 효능을 손상시키는지 여부는 알려지지 않았다. 폐포대식세포 efferocytosis에 있는 O 3-유도한 변경을 조사하는 것은 노출이 만성 폐 질병 부각 및 악화로 이끌어 낼 수 있는 방법에 잠재적인 통찰력을 제공할 것입니다. 아래에 기재된 간단한 방법은 급성O3 노출 후 암컷 마우스의 폐에서 폐포 대식세포 효능을 평가하는 간단한 방법이다.

설명된 방법은 값비싼 형광 염료, 광범위한 유동 세포 측정 및 폐포 대식세포의 생체 내 조작(24)의 사용을 제거함으로써 현장에서 일반적으로 사용되는 다른 efferocytosis 프로토콜에 비해 몇 가지 장점을 제시합니다. ,25. 추가적으로, 이 프로토콜은 폐 미세 환경의 맥락에서 폐 포식세포 efferocytosis를 측정합니다, 대식세포 기능에 영향을 미칠 수 있는.

Protocol

모든 방법은 이스트 캐롤라이나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 1. 오존 (O3)및 여과 된 공기 노출 (1 일차) 최대 12암컷 C57BL/6J 마우스를 8-12주 된 강철 케이지에 놓고(12개의 분리된 구획이 있음) 와이어 메쉬 뚜껑을O3 노출 챔버에 넣습니다. 온도계를 케이지가 있는 노출 챔버에 배치하여 온도와 습도를 정확하?…

Representative Results

O3 노출은 폐 염증 및 부상을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 조직 항상성을 유지하기 위해 효능이 요구된다. C57BL/6J 암컷 마우스는 여과된 공기(FA) 또는 1 ppmO3에 3시간 동안 노출되었고, 폐 염증 및 부상을 조사하기 위해 24시간 노출 후 노출을 부검하였다. O3-노출된마우스는 FA 대조군에 비해 영공에서 대식세포 및 호중구의 유의한 증가를 나타냈?…

Discussion

Efferocytosis는 대식세포가 세포 자멸 세포및 파편을 지우고 다중 항염증제 매개체9,10,11,12,16을 생성하는 항염증 과정입니다 ,18. 여러 모델의 세포세포증은 대식세포가 염증의 분해능에서 어떻게 중요한 세포인가에 대한 통찰력을 제공했다<sup class="x…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 건강 효과 연구소 월터 A. 로젠 블리스 상과 NIEHS R01ES028829에 의해 투자된다 (K. M. G에). 우리는 폐포 대식세포의 대표적인 이미지를 얻는 그녀의 도움에 대한 박사 다이앤 월터스 (생리학과, ECU)에게 감사드립니다.

Materials

Annexin V-FITC Kit Trevigen 4830-250-K  The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells  ATCC ATCC CRL-2899 The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. 
Countess II Automated Cell Counter Thermofisher AMQAX1000 It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher A78300003 Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Thermofisher 16140071 Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. 
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin Thermofisher 9990706 Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative Thermofisher 9990705 Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue Thermofisher 9990707 Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin Sigma/Aldrich P0781-100ML Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermofisher 61870036 RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker Cambridge Scientific  16659 The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer  Teledyne API T400 The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator Teledyne API T703 Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.
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Hodge, M. X., Reece, S. W., Madenspacher, J. H., Gowdy, K. M. In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (152), e60109, doi:10.3791/60109 (2019).
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