Dette manuskriptet beskriver en protokoll for å avgjøre om eksponering for ozon, et kriterium luftforurensning, svekker alveolære macrophage efferocytosis in vivo. Denne protokollen benytter ofte brukte reagenser og teknikker og kan tilpasses flere modeller av lungeskade for å bestemme effekter på alveolære macrophage efferocytosis.
Ozon (O3) er et kriterium luft forurensende som forverrer og øker forekomsten av kroniske lungesykdommer. O3 eksponering er kjent for å indusere lungebetennelse, men lite er kjent om hvordan eksponeringen endrer prosesser viktig for oppløsningen av betennelse. Efferocytosis er en oppløsning prosess, der makrofager phagocytize apoptotisk celler. Formålet med denne protokollen er å måle alveolære macrophage efferocytosis etter O3-indusert lungeskade og betennelse. Flere metoder har blitt beskrevet for å måle efferocytosis; men de fleste krever ex vivo manipulasjoner. Beskrevet i detalj her er en protokoll for å måle in vivo alveolære macrophage efferocytosis 24 timer etter O3 eksponering, noe som unngår ex vivo manipulering av makrofager og fungerer som en enkel teknikk som kan brukes til å nøyaktig representere forstyrrelser i Denne løsningsprosessen. Protokollen er en teknisk ikke-intensiv og relativt rimelig metode som involverer hele kroppen O3 inhalasjon etterfulgt av orofaryngeal aspirasjon av apoptotisk celler (dvs. Jurkat T celler) mens under narkose. Alveolære macrophage efferocytosis måles deretter ved lys mikroskopi evaluering av makrofager som er samlet inn fra lunges (BAL-tømming). Efferocytosis måles til slutt ved å beregne en efferocytic indeks. Kollektivt, de skisserte metodene kvantifisere efferocytic aktivitet i lungene in vivo samtidig tjene til å analysere negative helseeffekter av O3 eller andre inhalert fornærmelser.
Lunge er stadig utsatt for miljømessige fornærmelser, inkludert luft partikler, virus, bakterier, og oksiderende gasser som utløser lungebetennelse1,2,3. Disse fornærmelser kan kompromittere gassutveksling og indusere irreversible vevsskade4,5. Alveolære makrofager, som utgjør ca 95% av immunceller funnet i murine og menneskelige lunger ved homeostase, er kritiske regulatorer av lungebetennelse etter miljømessige fornærmelser1,2, 3,4,5. Alveolære makrofager er avgjørende i verts forsvaret ved å phagocytizing og eliminere patogener. Nylig, alveolære makrofager har vist å fremme vev homeostase og oppløsningen av betennelse gjennom efferocytosis6,7. Efferocytosis er en phagocytic prosess der makrofager sluker og eliminere apoptotisk celler8,9,10. Efferocytosis også resulterer i produksjon av meglere (dvs. Il-10, TGF-β, PGE2, og nitrogenoksid) som ytterligere utfylle prosessen, noe som resulterer i oppløsningen av betennelse9,10,11 ,12,16,18. Denne prosessen er nødvendig for å forebygge sekundær nekrose og fremme vev homeostase12,13,14. Flere studier har knyttet svekket efferocytosis med ulike kroniske lungesykdommer, inkludert astma, kronisk obstruktiv lungesykdom, og idiopatisk pulmonal fibrose8,9,15, 16,17.
O3 er et kriterium luft forurensende som forverrer og øker forekomsten av kroniske lungesykdommer19,20,21. O3 induserer lungebetennelse og skade og er kjent for å svekke alveolære macrophage fagocytose av bakterielle patogener22,23. Det er imidlertid ukjent om O3 svekker alveolære macrophage efferocytosis. Gransker O3-indusert endringer i alveolære macrophage efferocytosis vil gi potensiell innsikt i hvordan eksponering kan føre til kroniske lungesykdom forekomst og forverring. Beskrevet nedenfor er en enkel metode for å evaluere alveolære macrophage efferocytosis i lungene av kvinnelige mus etter akutt O3 eksponering.
Den skisserte metoden disponerer flere fordeler fremfor andre efferocytosis protokoller som vanligvis brukes i feltet ved å eliminere bruken av kostbare fluorescerende fargestoffer, omfattende strømnings flowcytometri målinger og ex vivo-manipulering av alveolære makrofager24 ,25. I tillegg denne protokollen tiltak alveolære macrophage efferocytosis i sammenheng med lunge mikromiljøet, som kan påvirke macrophage funksjon.
Efferocytosis er en anti-inflammatorisk prosess der makrofager Clear apoptotisk celler og rusk samt produsere flere anti-inflammatorisk meglere9,10,11,12,16 ,18. Flere modeller av efferocytosis har gitt innsikt i hvordan macrophage er en kritisk celle i oppløsningen av betennelse6,<sup cla…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien er finansiert av Health Effects Institute Walter A. Rosenblith Award og NIEHS R01ES028829 (til K. M. G). Vi vil gjerne takke Dr. Dianne Walters (Department of fysiologi, ECU) for hennes hjelp med å skaffe representative bilder av alveolære makrofager.
Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |