JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

Одноместный Synapse Показатели глюкамата релиз и поглощение в острый мозг фрагменты из нормальных и Хантингтон мышей

Published: March 11, 2020
doi:
10.3791/60113
,
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center,Charité – University Medicine

Summary

Мы представляем протокол для оценки баланса между высвобождение глутамата и очистки при одном кортикостриатических глутаматергических синапсах в острых ломтиках от взрослых мышей. Этот протокол использует флуоресцентный датчик iGluu для обнаружения глутамата, камеру sCMOS для получения сигнала и устройство для фокусного лазерного освещения.

Abstract

Синапсы являются высокоразрозненные функциональные единицы, которые работают независимо друг от друга. В болезни Гентингтона (HD) и других нейродегенеративных расстройств, эта независимость может быть поставлена под угрозу из-за недостаточного просвета глутамата и в результате разлива и разлива эффектов. Измененное астроцитарное покрытие пресинаптических терминалов и/или дендритных шипов, а также уменьшенный размер кластеров глутамата на участках высвобождения глутамата были вовлечены в патогенез заболеваний, приводящий к симптомам дис-/гиперкинезии. Тем не менее, механизмы, ведущие к дисфункции глутамерных синапсов в БГ не очень хорошо изучены. Улучшение и применение синапсов изображений мы получили данные, проливающие новый свет на механизмы, препятствующие инициированию движений. Здесь мы описываем основные элементы относительно недорогого подхода для достижения одного синапса резолюции с помощью нового генетически закодированного ультрабыстрого датчика глутамата iGluu, широкоугольной оптики, научной камеры CMOS (sCMOS), лазера 473 нм и лазерной системы позиционирования для оценки состояния кортикостриатальных синапсов в острых отрезков здорового возраста. Глютамат переходных были построены из одного или нескольких пикселей для получения оценок i) глутамата релиз на основе максимальной высоты концентрации глутамата (Глю) рядом с активной зоной и ii) поглощение глутамата, как отражено во времени постоянного распада (TauD) перисинаптического «Glu». Различия в размере покоя и контрастные модели краткосрочной пластичности служили критериями для идентификации кортикостриатальных терминалов как принадлежащих к интрателенцефалическому (ИТ) или пирамидальному тракту (PT). Используя эти методы, мы обнаружили, что в симптоматическом HD мышей 40% PT-типа кортикостриатических синапсов выставлены недостаточно глутамата зазор, предполагая, что эти синапсы могут быть подвержены риску excitotoxic повреждения. Результаты подчеркивают полезность TauD как биомаркера дисфункциональных синапсов у мышей Хантингтона с гипотинетическим фенотипом.

Introduction

Относительное влияние каждого синаптического терминала, принадлежащего к “унитарному соединению” (т.е. связь между 2 нервными клетками), как правило, оценивается по его влиянию на начальный сегмент постсинаптического нейрона1,2. Соматические и/или дендритные записи из постсинаптических нейронов представляют собой наиболее распространенные и, до сих пор, также наиболее продуктивные средства для уточнения обработки информации в сверху вниз или вертикальной точки зрения3,4,5. Однако наличие астроцитов с их дискретными и (у грызунов) неперекрывающихся территорий может способствовать горизонтальной перспективе, основанной на локальных механизмах обмена сигналами, интеграции и синхронизации на синапических участках66,77,88,10.10

Потому что известно, что астроглия играть, в общем, важную роль в патогенезе нейродегенеративного заболевания11,12 и, в частности, роль в поддержании и пластичности глутамерных синапсов13,14,15 ,16,16Можно себе представить, что изменения в синаптической производительности развиваться в соответствии с состоянием астроцитов в общей области. Для дальнейшего изучения целевых /астроглии, полученных местными механизмами регулирования в области здравоохранения и болезней, необходимо оценить отдельные синапсы. Нынешний подход был разработан для оценки диапазона функциональных показателей высвобождения и очистки глутамата и определения критериев, которые могут быть использованы для выявления дисфункциональных (или восстановленных) синапсов в областях мозга, наиболее тесно связанных с инициацией движения (т.е. в первую очередь в моторной коре и стриатуме).

Стриатум не хватает внутренних глутаматергических нейронов. Таким образом, относительно легко определить глутамерные афференты экстрастриатального происхождения. Последние в основном происходят в медиальной таламус и в коре головного мозга (см.17,,18,,19,,20 для более). Кортикостриатальные синапсы образуются аксонами пирамидальных нейронов, локализованных в корковых слоях 2/3 и 5. Соответствующие аксоны образуют двусторонние внутрителецефалические (ИТ) соединения или ipsilateral соединения через волоконную систему, которая более caudally представляет собой пирамидальный тракт (PT). Кроме того, было высказано предположение, что IT- и PT-типа терминалов отличаются по характеристикам выпуска и размер21,22. С учетом этих данных можно также ожидать некоторых различий в обращении с глутаматом.

Стриатум является наиболее пострадавших области мозга в болезни Гентингтона (HD)5. HD человека является тяжелым генетически наследственных нейродегенеративных расстройств. Модель мыши No175 дает возможность исследовать клеточную основу гипокинетико-жесткой формы БГ, состояния, которое имеет много общего с паркинсонизмом. Начиная с возраста около 1 года, гомозигота No 175 мышей (HOM) проявляют признаки гипокинезии, как показали путем измерения времени, проведенного без движения в открытом поле23. Нынешние эксперименты с гетерозиготными мышами No175 (HET) подтвердили предыдущий дефицит мотора, наблюдаемый в HOM, и, кроме того, показали, что наблюдаемый дефицит мотора сопровождался снижением уровня астроцитарной аминокислоты транспортера 2 белка (EAAT2) в непосредственной близости от кортикостриатических синапических терминалов24. Поэтому было предслоужно, что дефицит в астроцитарный глутамат поглощения может привести к дисфункции или даже потери соответствующих синапсов25,26.

Здесь мы описываем новый подход, который позволяет оценить один синапсный глутамат зазор по отношению к количеству выпущенного нейромедиатора. Новый датчик глутамата iGluu был выражен в кортикостриатических пирамидальных нейронов. Он был разработан Каталин Торек27 и представляет собой модификацию ранее введенного высокой сродства, но медленного датчика глутамата iGluSnFR28. Оба датчика являются производными улучшенного зеленого флуоресцентного белка (EGFP). Для спектральных и кинетические характеристики, см Helassa и др.27. Кратко, iGluu является низким сродством датчик с быстрой деактивации кинетики и, следовательно, особенно хорошо подходит для изучения глутамата зазор на глутамат-релизы синаптических терминалов. Время диссоциации iGluu было определено в устройстве с останавливаетися потока, что оказало Тауот значения 2.1 ms при 20 градусах По Цельсия, но 0.68 ms при экстраполировании до температуры 34 c27. Одноместные терминалы обеспечения Schaffer исследовали на 34 градуса с спиральным лазерным сканированием в регионе CA1 органотипических гиппокампа культур под 2-фотонным микроскопом выставлены среднее время константы распада 2,7 мс.

Protocol

Все работы были выполнены в соответствии с Директивой ЕС 2010/63/EU для экспериментов на животных и были зарегистрированы в Берлинском управлении по охране здоровья и технической безопасности (G0233/14 и G0218/17). ПРИМЕЧАНИЕ: Записи из no 175 дикого типа (WT) и гетерозиготы (HETs) могу…

Representative Results

Выявление двух типов кортикостриатального глутаматергического варикозного расширенияИТ и PT афференты происходят в слое 2/3 и 5, соответственно, и демонстрируют дифференциальные последствия и модели прекращения в ипсилатеральной и контрлатеральной (только ИТ-терминалы) striat…

Discussion

Эксперименты касаются вопроса общего интереса – синапсовой независимости и ее возможной потери в ходе нейродегенерации, и мы описываем новый подход к выявлению пораженных синапсов в острых ломтиках мозга от пожилых (зgt;1 год) мышей. Воспользовавшись улучшенными кинетической характери?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана CHDI (A-12467), Немецким исследовательским фондом (Exc 257/1 и DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) и интрамуральными исследовательскими фондами Шарите. Мы благодарим К. Торека, Сент-Джордж, Лондонский университет, и Н. Хелассу, Ливерпульский университет, за плазмид iGluu и множество полезных дискуссий. Д. Бетанс и А. Шёнхерр оказали отличную техническую помощь.

Materials

Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
  2. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
  3. Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56 (2018).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
  5. Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington’s disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
  6. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
  7. Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
  8. Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554 (2018).
  9. Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
  10. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239 (2018).
  11. Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
  12. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
  13. Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
  14. Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451 (2018).
  15. Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
  16. Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
  17. Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington’s disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
  18. Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington’s disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
  19. Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson’s disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
  20. Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
  21. Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
  22. Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons – dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142 (2010).
  23. Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. 신경과학. 311, 519-538 (2015).
  24. Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
  25. Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington’s disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
  26. Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
  27. Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
  28. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
  29. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2003).
  30. Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
  31. Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
  32. Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154 (2017).
  33. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
  34. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality–how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  35. Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
  36. Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
  37. Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
  38. Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
  39. Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
  40. Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
  41. Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
  42. Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, a. O., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
  43. Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
  44. Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19 (2019).
  45. Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
  46. Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington’s disease mice. Scientific Reports. 9, 6634 (2019).
  47. Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414 (2019).
  48. Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
  49. Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).

Tags

Single SynapseGlutamate ReleaseGlutamate UptakeAcute Brain SlicesHuntington MiceOne-photon MicroscopeAutofluorescence CorrectionDorsal StriatumStimulation PipetteAction Potential Dependent ReleaseIon Channel BlockersMembrane ReceptorsTetrototoxin
check_url/kr/60113?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image