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신경과학

Einzelne Synapsenindikatoren für Glutamatfreisetzung und Aufnahme in akuten Gehirnscheiben von normalen und Huntington-Mäusen

Published: March 11, 2020
doi:
10.3791/60113
,
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center,Charité – University Medicine

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll zur Bewertung des Gleichgewichts zwischen Glutamatfreisetzung und Clearance bei einzelnen kortikostriatalen glutamatergen Synapsen in akuten Scheiben von erwachsenen Mäusen. Dieses Protokoll verwendet den Fluoreszenzsensor iGluu zur Glutamaterkennung, eine sCMOS-Kamera zur Signalerfassung und ein Gerät zur fokalen Laserbeleuchtung.

Abstract

Synapsen sind hochteilige Funktionseinheiten, die unabhängig voneinander arbeiten. Bei der Huntington-Krankheit (HD) und anderen neurodegenerativen Erkrankungen könnte diese Unabhängigkeit aufgrund unzureichender Glutamat-Clearance und der daraus resultierenden Spill-in- und Spill-out-Effekte beeinträchtigt werden. Veränderte astrozytische Abdeckung der präsynaptischen Terminals und/oder dendritischen Stacheln sowie eine reduzierte Größe von Glutamat-Transporter-Clustern an Glutamat-Freisetzungsstellen wurden in die Pathogenese von Krankheiten verwickelt, die zu Symptomen von Dys-/Hyperkinesie führen. Jedoch, die Mechanismen, die zur Dysfunktion der glutamatergen Synapsen bei der Huntington-Krankheit führen, sind nicht gut verstanden. Um die Synapsenbildgebung zu verbessern und anzuwenden, haben wir Daten erhalten, die ein neues Licht auf die Mechanismen werfen, die die Einleitung von Bewegungen behindern. Hier beschreiben wir die Grundelemente eines relativ kostengünstigen Ansatzes zur Erzielung einer einheitlichen Synapsenauflösung mit dem neuen genetisch kodierten Ultraschnellglutamatsensor iGluu, Weitfeldoptik, einer wissenschaftlichen CMOS (sCMOS) Kamera, einem 473 nm Laser und einem Laser-Positionierungssystem zur Bewertung des Zustands von korticostriatalen Synapsen in akuten Scheiben ab altersgerechter Gesundheit oder krankheitserregenden Mäusen. Glutamattransienten wurden aus einzelnen oder mehreren Pixeln konstruiert, um Schätzungen von i) Glutamatfreisetzung basierend auf der maximalen Erhöhung der Glutamatkonzentration [Glu] neben der aktiven Zone und ii) Glutamataufnahme zu erhalten, wie sie in der Zeitkonstante des Zerfalls (TauD) des perisynaptischen [Glu] widergespiegelt wird. Unterschiede in der Ruhender Boutongröße und den kontrastierenden Mustern der kurzfristigen Plastizität dienten als Kriterien für die Identifizierung korticostriataler Terminals als Zugehörigkeit zum intratelenzephalen (IT) oder dem Pyramidal Trakt (PT) Pfad. Mit diesen Methoden entdeckten wir, dass bei symptomatischen Huntington-Mäusen 40 % der korticostriatalen Synapsen des PT-Typs eine unzureichende Glutamatclearance aufwiesen, was darauf hindeutet, dass diese Synapsen einem Risiko für exzitotoxische Schäden ausgesetzt sein könnten. Die Ergebnisse unterstreichen die Nützlichkeit von TauD als Biomarker für dysfunktionale Synapsen bei Huntington-Mäusen mit einem hypoeintischen Phänotyp.

Introduction

Die relative Wirkung jedes synaptischen Terminals, das zu einer “einheitlichen Verbindung” (d.h. der Verbindung zwischen 2 Nervenzellen) gehört, wird typischerweise durch seinen Einfluss auf das Anfangssegment des postsynaptischen Neurons1,2beurteilt. Somatische und/oder dendritische Aufnahmen von postsynaptischen Neuronen stellen die häufigsten und bis jetzt auch produktivsten Mittel zur Klärung der Informationsverarbeitung unter einer Top-down- oder vertikalen Perspektive3,4,5dar. Die Anwesenheit von Astrozyten mit ihren diskreten und (in Nagetieren) nicht überlappenden Gebieten kann jedoch zu einer horizontalen Perspektive beitragen, die auf lokalen Mechanismen des Signalaustauschs, der Integration und der Synchronisation an synaptischen Standorten6,7,8,9,10basiert.

Da bekannt ist, dass Astroglia im Allgemeinen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der neurodegenerativen Krankheit11,12 spielt und insbesondere eine Rolle bei der Aufrechterhaltung und Plastizität von glutamatergen Synapsen13,14,15,16, ist es denkbar, dass sich Veränderungen der synaptischen Leistung in Übereinstimmung mit dem Zustand der Astrozyten im gemeinsamen Zielbereich von afferent Fasern mit unterschiedlichem Ursprung entwickeln. Um die von den Ziel- und Astroglia-abgeleiteten lokalen Regulierungsmechanismen bei Gesundheit und Krankheit weiter zu erforschen, ist es notwendig, einzelne Synapsen zu bewerten. Der vorliegende Ansatz wurde ausgearbeitet, um den Bereich der funktionellen Glutamatfreisetzungs- und Clearance-Indikatoren zu schätzen und Kriterien zu definieren, die verwendet werden können, um dysfunktionale (oder wiedergewonnene) Synapsen in Hirnbereichen zu identifizieren, die am engsten mit der Bewegungsinitiierung zusammenhängen (d. h. zunächst im motorischen Kortex und dorsal striatum).

Dem Striatum fehlen intrinsische glutamaterge Neuronen. Daher ist es relativ einfach, glutamaterge Afferenten außerstriatalen Ursprungs zu identifizieren. Letztere stammen meist aus dem medialen Thalamus und in der Großhirnrinde (siehe17,18,19,20 für mehr). Corticostriatal Synapsen werden durch die Axone von pyramidenförmigen Neuronen in kortikalen Schichten 2/3 und 5 lokalisiert gebildet. Die jeweiligen Axone bilden bilaterale intratelenzephale (IT) Verbindungen oder ipsilaterale Verbindungen über ein Fasersystem, das den Pyramidentrakt (PT) eher kauarisch bildet. Es wurde ferner vorgeschlagen, dass sich IT- und PT-Terminals in ihren Freigabeeigenschaften und Größe21,22unterscheiden. Angesichts dieser Daten könnte man auch einige Unterschiede im Umgang mit Glutamat erwarten.

Das Striatum ist der am stärksten betroffene Hirnbereich bei der Huntington-Krankheit (HD)5. Die menschliche Huntington-Krankheit ist eine schwere genetisch vererbte neurodegenerative Erkrankung. Das Q175-Mausmodell bietet die Möglichkeit, die zelluläre Basis der hypoeinetisch-starren Form der Huntington-Krankheit zu untersuchen, einem Zustand, der viel mit Parkinsonismus gemein hat. Ab einem Alter von etwa 1 Jahr zeigen homozygote Q175-Mäuse (HOM) Anzeichen von Hypokinesie, wie sich aus der Messung der Zeit ohne Bewegung in einem offenen Feld zeigt23. Die vorliegenden Experimente mit heterozygoten Q175-Mäusen (HET) bestätigten die zuvor beobachteten motorischen Defizite in HOM und zeigten darüber hinaus, dass die beobachteten motorischen Defizite von einem reduzierten Niveau des astrozytären exzitatorischen Aminosäuretransporters 2 Protein (EAAT2) in unmittelbarer Nähe der kortikostktalen synaptischen Klemmen24begleitet wurden. Es wurde daher vermutet, dass ein Defizit in der astrozytischen Glutamataufnahme zu Dysfunktion oder sogar zum Verlust der jeweiligen Synapsen führen könnte25,26.

Hier beschreiben wir einen neuen Ansatz, der es erlaubt, einzelne Synapseglutamat-Clearance relativ zur Menge des freigesetzten Neurotransmitters zu bewerten. Der neue Glutamatsensor iGluu wurde in kortikostktalen Pyramidenneuronen exprimiert. Es wurde von Katalin Török27 entwickelt und stellt eine Modifikation des zuvor eingeführten hochaffinen, aber langsamen Glutamatsensors iGluSnFR28dar. Beide Sensoren sind Derivate des verbesserten grünen Fluoreszenzproteins (EGFP). Für spektrale und kinetische Eigenschaften siehe Helassa et al.27. Kurz gesagt, iGluu ist ein Sensor mit geringer Affinität mit schneller Deaktivierungskinetik und daher besonders gut geeignet, um die Glutamatclearance an Glutamat-releasing synaptischen Klemmen zu untersuchen. Die Dissoziationszeitkonstante von iGluu wurde in einer Stoppstromvorrichtung ermittelt, die einenTau-Ab-Wert von 2,1 ms bei 20 °C, aber 0,68 ms bei hochgerechneter Temperatur von 34 °C27ergab. Einzelne Schaffer-Kollateralklemmen, die bei 34 °C mit Spirallaserscanning im CA1-Bereich organotypischer Hippocampuskulturen unter einem 2-Photonenmikroskop untersucht wurden, wiesen eine mittlere Zerfallskonstante von 2,7 ms auf.

Protocol

Alle Arbeiten wurden gemäß der EU-Richtlinie 2010/63/EU für Tierversuche durchgeführt und beim Berliner Amt für Gesundheitsschutz und technische Sicherheit (G0233/14 und G0218/17) registriert. HINWEIS: Aufnahmen von Q175 Wildtyp (WT) und Heterozygoten (HETs) können in jedem Alter und Geschlecht durchgeführt werden. Hier haben wir Männchen und Weibchen im Alter von 51 bis 76 Wochen untersucht. 1. Injektion des Glutamat-Sensors iGluu…

Representative Results

Identifizierung von zwei Arten von korticostriatalen glutamatergen EnkothekenIT- und PT-Afferenten stammen aus den Schichten 2/3 bzw. 5 und weisen unterschiedliche Verzweigungs- und Abschlussmuster im ipsilateralen und kontralateralen (nur IT-Terminals) Striatum auf. Über die Eigenschaften der Glutamatfreisetzung und -freigabe unter sich wiederholenden Aktivierungsbedingungen, wie sie bei der Einleitung von Bewegungen beobachtet wurden, ist noch wenig bekannt, aber es ist gut dokumentiert, dass sich…

Discussion

Die Experimente betreffen eine Frage von allgemeinem Interesse – Synapsenunabhängigkeit und deren möglicher Verlust im Verlauf der Neurodegeneration, und wir beschreiben einen neuen Ansatz zur Identifizierung betroffener Synapsen in akuten Hirnscheiben von gealterten (>1 Jahr) Mäusen. Unter Ausnutzung der verbesserten kinetischen Eigenschaften des kürzlich eingeführten Glutamatsensors iGluu beleuchten die Experimente die Beziehung zwischen synaptischer Glutamatfreisetzung und Aufnahme auf eine Weise, di…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von CHDI (A-12467), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Exc 257/1 und DFG-Projekt-ID 327654276 – SFB 1315) und den intramuraischen Forschungsfonds der Charité unterstützt. Wir danken K. Török, St. George es, University of London, und N. Helassa, University of Liverpool, für das iGluu Plasmid und viele hilfreiche Diskussionen. D. Betances und A. Schönherr leisteten hervorragende technische Unterstützung.

Materials

Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI
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References

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Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).
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