JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
신경과학

Enkelt synapse indikatorer for glutamat frigivelse og optagelse i akut hjerne skiver fra normal og Huntington Mus

Published: March 11, 2020
doi:
10.3791/60113
,
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center,Charité – University Medicine

Summary

Vi præsenterer en protokol til at evaluere balancen mellem glutamat frigivelse og clearance på enkelt korticostriatal glutamatergic synapser i akutte skiver fra voksne mus. Denne protokol bruger fluorescerende sensor iGluu til glutamat detektion, en sCMOS kamera til signal erhvervelse og en enhed til fokal laser belysning.

Abstract

Synapser er stærkt opdelte funktionelle enheder, der fungerer uafhængigt på hinanden. Ved Huntingtons Sygdom (HS) og andre neurodegenerative lidelser kan denne uafhængighed blive kompromitteret på grund af utilstrækkelig glutamatclearance og de deraf følgende udslips- og udslipseffekter. Ændret astrocytisk dækning af de presynaptiske terminaler og/eller dendritiske pigge samt en reduceret størrelse af glutamattransporterklynger på glutamatfrigivelsessteder har været involveret i patogenesen af sygdomme, der resulterer i symptomer på dys-/hyperkinesi. Men de mekanismer, der fører til dysfunktion af glutamatergic synapser i HS, er ikke godt forstået. Forbedring og anvendelse synapse imaging vi har fået data kaste nyt lys over de mekanismer, der hindrer indledningen af bevægelser. Her beskriver vi de vigtigste elementer i en relativt billig tilgang til at opnå en enkelt synapse opløsning ved hjælp af den nye genetisk kodede ultrahurtige glutamat sensor iGluu, wide-field optik, en videnskabelig CMOS (sCMOS) kamera, en 473 nm laser og en laser positionering system til at vurdere tilstanden af korticostriatal synapser i akutte skiver fra alder passende sunde eller syge mus. Glutamattransienter blev konstrueret ud fra enkelte eller flere pixels for at opnå skøn over i) glutamatfrigivelse baseret på den maksimale højde af glutamatkoncentrationen [Glu] ved siden af den aktive zone og ii) glutamatoptagelse som afspejlet i tidskonstanten af henfald (TauD) af perisyaptisk [Glu]. Forskelle i hvilebouton størrelse og kontrasterende mønstre af kortsigtede plasticitet tjente som kriterier for identifikation af korticostital terminaler som tilhører intratelencephalic (IT) eller pyramideformede tarmkanalen (PT) vej. Ved hjælp af disse metoder opdagede vi, at i symptomatiske HS-mus ~ 40% af PT-type korticostriatal synapser udviste utilstrækkelig glutamat clearance, hvilket tyder på, at disse synapser kan være i risiko for excitotoksiske skader. Resultaterne understreger nytten af TauD som en biomarkør for dysfunktionelle synapser hos HS-mus med en hypokinetisk fænotype.

Introduction

Den relative virkning af hver synaptisk terminal, der tilhører en “enhedsforbindelse” (dvs. forbindelsen mellem 2 nerveceller) vurderes typisk ved dens indflydelse på det oprindelige segment af den postsynaptiske neuron1,2. Somatiske og/eller dendritiske optagelser fra postsynaptiske neuroner udgør de mest almindelige og indtil nu også de mest produktive midler til at afklare informationsbehandling under et top-down eller vertikalt perspektiv3,4,5. Tilstedeværelsen af astrocytter med deres diskrete og (i gnavere) ikke-overlappende områder kan imidlertid bidrage med et horisontalt perspektiv , der er baseret på lokale mekanismer for signaludveksling, integration og synkronisering på synaptiske steder6,7,8,9,10.

Fordi det er kendt, at astroglia spiller, i almindelighed, en stor rolle i patogenesen af neurodegenerative sygdomme11,12 og især en rolle i vedligeholdelse og plasticitet af glutamatergic synapser13,14,15,16, er det tænkeligt, at ændringer i synaptiske ydeevne udvikler sig i overensstemmelse med tilstanden af astrocytter i det fælles målområde af ferente fibre med forskellig oprindelse. For yderligere at undersøge de mål-/astroglia-afledte lokale reguleringsmekanismer inden for sundhed og sygdom er det nødvendigt at evaluere individuelle synapser. Denne tilgang blev udarbejdet for at vurdere rækken af funktionelle glutamat frigivelse og clearance indikatorer og til at definere kriterier, der kan anvendes til at identificere dysfunktionelle (eller genvundne) synapser i hjernen områder tættest relateret til bevægelse indledning (dvs. først og fremmest i den motoriske cortex og dorsale striatum).

Striatum mangler iboende glutamatergic neuroner. Derfor er det relativt let at identificere glutamatergic afferents af extrastriatal oprindelse. Sidstnævnte stammer for det meste i den mediale thalamus og i hjernebarken (se17,18,19,20 for mere). Korticostriatal synapser dannes af axoner af pyramideformede neuroner lokaliseret i kortikale lag 2/3 og 5. De respektive axoner danner bilaterale intra-telencephalic (IT) forbindelser eller ipsilaterale forbindelser via et fibersystem, der mere caudally udgør den pyramideformede tarmkanalen (PT). Det er endvidere blevet foreslået , at it- og PT-typeterminaler er forskellige med hensyn til deres frigivelseskarakteristika og størrelse21,22. I lyset af disse data kunne man også forvente visse forskelle i håndteringen af glutamat.

Striatum er det hårdest ramte hjerneområde ved Huntingtons Sygdom (HS)5. Human HS er en alvorlig genetisk arvelig neurodegenerativ lidelse. Q175-musemodellen giver mulighed for at undersøge det cellulære grundlag af den hypokinetiske stive form for HS, en tilstand, der har meget til fælles med parkinsonisme. Starter i en alder af omkring 1 år, homozygote Q175 mus (HOM) udviser tegn på hypokinesi, som det fremgår ved at måle den tid, der bruges uden bevægelse i et åbent felt23. De nuværende forsøg med heterozygote Q175-mus (HET) bekræftede de tidligere motoriske underskud, der blev observeret i HOM, og viste desuden, at de observerede motoriske underskud var ledsaget af et reduceret niveau af den astrocytiske eksterionsyretransportør 2 protein (EAAT2) i umiddelbar nærhed af korticostiriatal synaptiske terminaler24. Det har derfor været en hypotese , at et underskud i udbredelsen af astrocytisk glutamat kan føre til dysfunktion eller endog tab af respektive synapser25,26.

Her beskriver vi en ny tilgang, der gør det muligt at evaluere enkelt synapse glutamat clearance i forhold til mængden af den frigivne neurotransmitter. Den nye glutamat sensor iGluu blev udtrykt i korticostriatal pyramideformede neuroner. Det blev udviklet af Katalin Török27 og repræsenterer en ændring af den tidligere indførte høj-affinitet, men langsom glutamat sensor iGluSnFR28. Begge sensorer er derivater af det forbedrede grønne fluorescerende protein (EGFP). For spektrale og kinetiske egenskaber, se Helassa et al.27. Kort, iGluu er en lav-affinitet sensor med hurtig de-aktivering kinetik og derfor særligt velegnet til at studere glutamat clearance på glutamat-releasing synaptiske terminaler. Dissociationstidskonstanten for iGluu blev bestemt i en stop-flow-anordning, som afgjorde enTau-offværdi på 2,1 ms ved 20 °C, men 0,68 ms, når den ekstrapoleres til en temperatur på 34 °C27. Enkelt Schaffer sikkerhedsstillelse terminaler undersøgt ved 34 °C med spiral laserscanning i CA1 regionen organotypic hippocampal kulturer under en 2-foton mikroskop udstillet en gennemsnitlig tid konstant af henfald på 2,7 ms.

Protocol

Alt arbejde er udført i overensstemmelse med EU-direktiv 2010/63/EU for dyreforsøg og blev registreret på Kontoret for Sundhedsbeskyttelse og Teknisk Sikkerhed i Berlin (G0233/14 og G0218/17). BEMÆRK: Optagelser fra Q175 wild-type (WT) og heterozygoter (HETs) kan udføres i alle aldre og køn. Her studerede vi mænd og kvinder i en alder af 51 til 76 uger. 1. Injektion af glutamatsensoren iGluu for udtryk i korticostriatal axoner <…

Representative Results

Identifikation af to typer korticostital glutamaterge varicositiesIT og PT afferentes stammer fra henholdsvis lag 2/3 og 5 og udviser differensforgrenings- og termineringsmønstre i det ipsilaterale og kontralaterale (kun IT-terminaler) striatum. Der vides stadig kun lidt om egenskaberne af glutamatfrigivelse og clearance under gentagne aktiveringsbetingelser som observeret under påbegyndelse af bevægelser, men det er veldokumenteret, at de respektive glutamat-releasing varicosities varierer i stø…

Discussion

Forsøgene vedrører et spørgsmål af almen interesse — synapse uafhængighed og dens mulige tab i løbet af neurodegeneration, og vi beskriver en ny tilgang til at identificere berørte synapser i akutte hjerneskiver fra alderen (>1 år) mus. Drage fordel af de forbedrede kinetiske egenskaber af den nyligt indførte glutamat sensor iGluu eksperimenterne belyse forholdet mellem synaptisk glutamat frigivelse og optagelse på en måde, der ikke har været muligt før.

Indflydelsen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af CHDI (A-12467), den tyske forskningsfond (Exc 257/1 og DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) og intramural Research Funds of the Charité. Vi takker K. Török, St. George’s, University of London, og N. Helassa, University of Liverpool, for iGluu plasmid og mange nyttige diskussioner. D. Betances og A. Schönherr ydede fremragende teknisk bistand.

Materials

Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
  2. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
  3. Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56 (2018).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
  5. Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington’s disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
  6. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
  7. Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
  8. Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554 (2018).
  9. Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
  10. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239 (2018).
  11. Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
  12. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
  13. Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
  14. Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451 (2018).
  15. Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
  16. Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
  17. Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington’s disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
  18. Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington’s disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
  19. Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson’s disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
  20. Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
  21. Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
  22. Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons – dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142 (2010).
  23. Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. 신경과학. 311, 519-538 (2015).
  24. Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
  25. Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington’s disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
  26. Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
  27. Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
  28. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
  29. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2003).
  30. Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
  31. Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
  32. Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154 (2017).
  33. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
  34. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality–how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  35. Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
  36. Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
  37. Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
  38. Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
  39. Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
  40. Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
  41. Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
  42. Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, a. O., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
  43. Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
  44. Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19 (2019).
  45. Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
  46. Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington’s disease mice. Scientific Reports. 9, 6634 (2019).
  47. Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414 (2019).
  48. Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
  49. Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).

Tags

Single SynapseGlutamate ReleaseGlutamate UptakeAcute Brain SlicesHuntington MiceOne-photon MicroscopeAutofluorescence CorrectionDorsal StriatumStimulation PipetteAction Potential Dependent ReleaseIon Channel BlockersMembrane ReceptorsTetrototoxin
check_url/kr/60113?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image