Summary

Indicateurs synapses uniques de la libération et de l’absorption des glutamates dans les tranches cérébrales aigues des souris normales et huntingtones

Published: March 11, 2020
doi:

Summary

Nous présentons un protocole pour évaluer l’équilibre entre la libération de glutamate et le dégagement aux synapses glutamatergics corticostriatal simples dans des tranches aigues des souris adultes. Ce protocole utilise le capteur fluorescent iGluu pour la détection de glutamate, une caméra sCMOS pour l’acquisition du signal et un dispositif pour l’éclairage laser focal.

Abstract

Les synapses sont des unités fonctionnelles hautement compartimentées qui fonctionnent indépendamment les unes sur les autres. Dans la maladie de Huntington (MH) et d’autres troubles neurodégénératifs, cette indépendance pourrait être compromise en raison de l’élimination insuffisante du glutamate et des effets de déversement et de déversement qui en résultent. La couverture astrocytique altérée des terminaux et/ou des épines dendritiques altérées ainsi qu’une taille réduite des grappes de transport de glutamate aux sites de rejet de glutamate ont été impliquées dans la pathogénie des maladies ayant pour résultat des symptômes de dys-/hyperkinésie. Cependant, les mécanismes menant au dysfonctionnement des synapses glutamatergiques dans la MH ne sont pas bien compris. Améliorer et appliquer l’imagerie synapse, nous avons obtenu des données jetant un nouvel éclairage sur les mécanismes empêchant l’initiation des mouvements. Ici, nous décrivons les principaux éléments d’une approche relativement peu coûteuse pour atteindre une seule résolution synapse en utilisant le nouveau capteur de glutamate ultra-rapide génétiquement codé iGluu, optique à champ large, une caméra scientifique CMOS (sCMOS), un laser de 473 nm et un système de positionnement laser pour évaluer l’état des synapses corticostriatales dans les tranches aigues de souris saines ou malades appropriées de l’âge. Les transitoires de glutamate ont été construites à partir de pixels simples ou multiples pour obtenir des estimations de la libération de glutamate i) basée sur l’élévation maximale de la concentration de glutamate [Glu] à côté de la zone active et ii) l’absorption de glutamate comme reflété dans la constante de temps de décomposition (TauD) du perisynaptique [Glu]. Les différences dans la taille du bouton de repos et les modèles contrastés de plasticité à court terme ont servi de critères pour l’identification des terminaux corticostriatal comme appartenant à la voie intratelencéphalique (IT) ou du tractus pyramidal (PT). En utilisant ces méthodes, nous avons découvert que chez les souris MH symptomatiques – 40% des synapses corticostriatal de type PT présentaient un dégagement insuffisant de glutamate, ce qui suggère que ces synapses pourraient être à risque de dommages excitoxiques. Les résultats soulignent l’utilité du TauD en tant que biomarqueur des synapses dysfonctionnelles chez les souris Huntington avec un phénotype hypokinétique.

Introduction

L’impact relatif de chaque terminal synaptique appartenant à une « connexion unitaire » (c.-à-d. la connexion entre 2 cellules nerveuses) est généralement évalué par son influence sur le segment initial du neurone postynaptique1,2. Les enregistrements somatiques et/ou dendritiques des neurones postsynaptiques représentent les moyens les plus courants et, jusqu’à présent, aussi les moyens les plus productifs de clarifier le traitement de l’information sous une perspective descendante ou verticale3,4,5. Cependant, la présence d’astrocytes avec leurs territoires discrets et (chez les rongeurs) non-overlapping peut contribuer à une perspective horizontale qui est basée sur les mécanismes locaux d’échange de signaux, d’intégration et de synchronisation aux sites synaptiques6,7,8,9,10.

Parce qu’on sait que les astroglias jouent, en général, un rôle majeur dans la pathogénie de la maladie neurodégénérative11,12 et, en particulier, un rôle dans l’entretien et la plasticité des synapses glutamatergiques13,14,15,16, il est concevable que les modifications de la performance synaptique évoluent en fonction de l’état des astrocytes dans la zone cible partagée des fibres afferentes avec diverses origines. Pour explorer davantage les mécanismes de réglementation locaux dérivés de la cible/astroglia dans la santé et la maladie, il est nécessaire d’évaluer les synapses individuelles. La présente approche a été élaborée pour estimer la gamme d’indicateurs fonctionnels de rejet et de dégagement du glutamate et pour définir des critères qui peuvent être utilisés pour identifier les synapses dysfonctionnelles (ou récupérées) dans les zones du cerveau les plus étroitement liées à l’initiation des mouvements (c.-à-d. tout d’abord dans le cortex moteur et le striatum dorsale).

Le striatum manque de neurones glutamatergiques intrinsèques. Par conséquent, il est relativement facile d’identifier les afferents glutamatergiques d’origine extrastriatale. Ce dernier provient principalement du thalamus médial et du cortex cérébral (voir17,18,19,,20 pour plus). Les synapses corticostriatales sont formées par les axones des neurones pyramidaux localisés dans les couches corticales 2/3 et 5. Les axones respectifs forment des connexions bilatérales intra-télencéphaliques (IT) ou des connexions ipsilateral via un système de fibres qui constitue plus caudally le tractus pyramidal (PT). Il a également été suggéré que les terminaux de type IT et PT diffèrent dans leurs caractéristiques de libération et la taille21,22. Compte tenu de ces données, on pourrait également s’attendre à des différences dans le traitement du glutamate.

Le striatum est la zone du cerveau la plus touchée dans la maladie de Huntington (HD)5. La MH humaine est un trouble neurodégénératif génétiquement héréditaire grave. Le modèle de souris Q175 offre l’occasion d’étudier la base cellulaire de la forme hypokinétique-rigide de la MH, un état qui a beaucoup en commun avec le parkinsonisme. À partir d’un âge d’environ 1 an, les souris homozygote Q175 (HOM) présentent des signes d’hypokinésie, comme révélé en mesurant le temps passé sans mouvement dans un champ ouvert23. Les expériences actuelles avec des souris hétérozygote Q175 (HET) ont confirmé les déficits moteurs précédents observés dans LE CDM et, en outre, ont montré que les déficits moteurs observés étaient accompagnés d’un niveau réduit du transporteur d’acide aminé excitatoire astrocytique 2 protéine (EAAT2) dans le voisinage immédiat des terminaux synaptiques corticostriatal24. Il a donc été supposé qu’un déficit dans l’absorption astrocytique de glutamate pourrait conduire à un dysfonctionnement ou même à la perte de synapses respectives25,26.

Ici, nous décrivons une nouvelle approche qui permet d’évaluer le dégagement unique de glutamate de synapse par rapport à la quantité du neurotransmetteur libéré. Le nouveau capteur de glutamate iGluu a été exprimé dans les neurones pyramidaux corticostriatal. Il a été développé par Katalin Târôk27 et représente une modification du capteur de glutamate de haute affinité précédemment introduit mais lent iGluSnFR28. Les deux capteurs sont des dérivés de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP). Pour les caractéristiques spectrales et cinétiques, voir Helassa et al.27. En bref, iGluu est un capteur de faible affinité avec une cinétique rapide de désactivation et donc particulièrement bien adapté pour étudier le dégagement de glutamate aux terminaux synaptiques de glutamate-libération. La constante de temps de dissociation d’iGluu a été déterminée dans un dispositif d’arrêt-flux, qui a rendu un Tauhors valeur de 2,1 ms à 20 oC, mais 0,68 ms lorsqu’il est extrapolé à une température de 34 oC27. Les terminaux collatéraux Schaffer simples sondés à 34 oC avec balayage de laser en spirale dans la région de CA1 des cultures hippocampales organotypiques sous un microscope de 2-photon ont montré une constante moyenne de temps de décomposition de 2,7 ms.

Protocol

Tous les travaux ont été effectués conformément à la directive de l’UE 2010/63/UE pour les expériences animales et ont été enregistrés au Bureau de la protection de la santé et de la sécurité technique de Berlin (G0233/14 et G0218/17). REMARQUE : Les enregistrements de type sauvage Q175 (WT) et hétérozygotes (HET) peuvent être effectués à tout âge et sexe. Ici, nous avons étudié les hommes et les femmes à un âge de 51 à 76 semaines. 1…

Representative Results

Identification de deux types de varicosses glutamatergiques corticostriataleLes afferents d’it et de PT proviennent respectivement des couches 2/3 et 5, et présentent des modèles différentiels de ramification et de terminaison dans le striatum ipsilateral et contralatéral (terminaux IT seulement). On sait encore peu de choses sur les propriétés de la libération et du dégagement du glutamate dans des conditions d’activation répétitives observées lors de l’initiation des mouvements, ma…

Discussion

Les expériences concernent une question d’intérêt général — l’indépendance synapse et sa perte possible au cours de la neurodégénérescence, et nous décrivons une nouvelle approche pour identifier les synapses affectées dans les tranches cérébrales aigues des souris âgées (1 an). Profitant des caractéristiques cinétique améliorées du capteur de glutamate récemment introduit iGluu les expériences éclairent la relation entre la libération synaptique de glutamate et l’absorption d’…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été soutenus par CHDI (A-12467), la Fondation allemande de recherche (Exc 257/1 et DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) et les Fonds de recherche intra-muros de la Charité. Nous remercions K. Tûrôk, St. George’s, Université de Londres, et N. Helassa, Université de Liverpool, pour l’iGluu plasmid et de nombreuses discussions utiles. D. Betances et A. Schonherr ont fourni une excellente assistance technique.

Materials

Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI

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Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).

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