ग्लूटामेट रिलीज के एकल सिनैप्स संकेतक और सामान्य और हंटिंगटन चूहों से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में तेज
Summary
हम वयस्क चूहों से तीव्र स्लाइस में एकल कोर्टिकोस्टल ग्लूटामिटल ग्लूटाएग्नेस सिनेप्स में ग्लूटामेट रिलीज और निकासी के बीच संतुलन का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। यह प्रोटोकॉल ग्लूटामेट डिटेक्शन के लिए फ्लोरोसेंट सेंसर iGluयू, सिग्नल अधिग्रहण के लिए एक एससीएमओएस कैमरा और फोकल लेजर रोशनी के लिए एक डिवाइस का उपयोग करता है।
Abstract
सिनेप्स अत्यधिक विभाजित कार्यात्मक इकाइयां हैं जो एक दूसरे पर स्वतंत्र रूप से काम करती हैं। हंटिंगटन रोग (एचडी) और अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में, अपर्याप्त ग्लूटामेट निकासी और परिणामस्वरूप फैल-इन और फैल-आउट प्रभावों के कारण इस स्वतंत्रता से समझौता किया जा सकता है। प्रेग्नेंसी टर्मिनलों और/या डेंड्रिटिक कताई के साथ-साथ ग्लूटामेट रिलीज साइटों पर ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर समूहों के कम आकार के परिवर्तित एस्ट्रोसाइटिक कवरेज को डायस/हाइपरकिनेशिया के लक्षणों के परिणामस्वरूप बीमारियों के रोगजनन में फंसाया गया है । हालांकि, एचडी में ग्लूटाम्जिक सिनेप्स की शिथिलता के लिए अग्रणी तंत्र अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहा है। सुधार और synapse इमेजिंग लागू हम आंदोलनों की दीक्षा में बाधा तंत्र पर नई रोशनी बहा डेटा प्राप्त किया है । यहां, हम नए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड अल्ट्राफास्ट ग्लूटामेट सेंसर iGluयू,वाइड-फील्ड ऑप्टिक्स, एक वैज्ञानिक सीएमओएस (sCMOS) कैमरा, एक 473 एनएम लेजर और एक लेजर पोजिशनिंग सिस्टम का उपयोग करके एक अनिवार्य रूप से सस्ती दृष्टिकोण के सिद्धांत तत्वों का वर्णन करते हैं ताकि उम्र उपयुक्त स्वस्थ या रोग से तीव्र स्लाइस में कोर्टिकोस्टल सिनेप्स की स्थिति का मूल्यांकन किया जा सके। ग्लूटामेट क्षणिकों का निर्माण एकल या कई पिक्सल से किया गया था, जो मैं का अनुमान प्राप्त करने के लिए) सक्रिय क्षेत्र के बगल में ग्लूटामेट एकाग्रता [ग्लू] की अधिकतम ऊंचाई के आधार पर ग्लूटामेट रिलीज और 2) ग्लूटामेट तेज के रूप में पेरिसिनैप्टिक [ग्लू] के क्षय (TauD) के निरंतर समय में परिलक्षित होता है। आराम के बावन आकार और अल्पकालिक प्लास्टिसिटी के विषम पैटर्न में अंतर इंट्राटेलेएंसेफेलिक (आईटी) या पिरामिड ट्रैक्ट (पीटी) मार्ग से संबंधित कॉर्टिकोस्टरिटल टर्मिनलों की पहचान के लिए मानदंड के रूप में कार्य करता है। इन तरीकों का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि रोगसूचक एचडी चूहों में ~ 40% पीटी-प्रकार कॉर्टिकोस्टरीटल सिनेप्स ने अपर्याप्त ग्लूटामेट क्लीयरेंस का प्रदर्शन किया, जिससे यह सुझाव दिया गया कि इन सिनेप्स को एक्सिटोटॉक्सिक क्षति का खतरा हो सकता है। परिणाम एक हाइपोकाइनेटिक फेनोटाइप के साथ हंटिंगटन चूहों में बेकार सिनेप्स के बायोमार्कर के रूप में TauD की उपयोगिता को रेखांकित करते हैं।
Introduction
“एकात्मक कनेक्शन” (यानी, 2 तंत्रिका कोशिकाओं के बीच संबंध) से संबंधित प्रत्येक सिनैप्टिक टर्मिनल का सापेक्ष प्रभाव आमतौर पर पोस्टसिनैप्टिक न्यूरॉन1,,2के प्रारंभिक खंड पर इसके प्रभाव से मूल्यांकन किया जाता है। पोस्टसिनैप्टिक न्यूरॉन्स से दैहिक और/या डेंड्रिटिक रिकॉर्डिंग सबसे आम का प्रतिनिधित्व करती है और अब तक, टॉप-डाउन या वर्टिकल पर्सनैलिटी3,4,4,5के तहत सूचना प्रसंस्करण को स्पष्ट करने का सबसे उत्पादक साधन भी है । हालांकि, उनके असतत और (कृंतक में) गैर-ओवरलैपिंग क्षेत्रों के साथ एस्ट्रोसाइट्स की उपस्थिति एक क्षैतिज परिप्रेक्ष्य में योगदान दे सकती है जो सिनैप्टिक साइटों6,,7,,8,,9,,10पर सिग्नल एक्सचेंज, एकीकरण और सिंक्रोनाइजेशन के स्थानीय तंत्र पर आधारित है।
क्योंकि यह ज्ञात है कि खगोलग्लिया सामान्य रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग11,,12 के रोगजनकों में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं और विशेष रूप से, ग्लूटाजेक्शियल सिनेप्स13,14,,,15,,16के रखरखाव और प्लास्टिसिटी में एक भूमिका, यह बोधगम्य है कि सिनैप्टिक प्रदर्शन में परिवर्तन एस्ट्रोसाइट्स की स्थिति के अनुसार विकसित होता है। स्वास्थ्य और रोग में लक्ष्य/एस्ट्रोग्लिया-व्युत्पन्न स्थानीय नियामक तंत्रों का और पता लगाने के लिए, व्यक्तिगत सिनेप्स का मूल्यांकन करना आवश्यक है । वर्तमान दृष्टिकोण कार्यात्मक ग्लूटामेट रिलीज और निकासी संकेतकों की सीमा का अनुमान लगाने और मानदंडों को परिभाषित करने के लिए तैयार किया गया था जिसका उपयोग मस्तिष्क क्षेत्रों में बेकार (या बरामद) सिनेप्स की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो आंदोलन दीक्षा से निकटता से संबंधित है (यानी, मोटर कॉर्टेक्स और डोर्सल स्ट्रेटम में सबसे पहले)।
स्ट्रेटम में आंतरिक ग्लूटामर्गिक न्यूरॉन्स का अभाव है। इसलिए, एक्स्ट्राट्राइटल मूल के ग्लूटामर्गिक एफ्रेरेंट की पहचान करना अपेक्षाकृत आसान है। उत्तरार्द्ध ज्यादातर मध्यस्थ थैलेसीमिया में और सेरेब्रल कॉर्टेक्स में उत्पन्न होता है (अधिक के लिए17,,18,,19,,20 देखें)। कोर्टिकोस्टल सिनेप्स कॉर्टिकल परतों 2/3 और 5 में स्थानीयकृत पिरामिड न्यूरॉन्स के अक्षों द्वारा बनाए जाते हैं। संबंधित एक्सोन एक फाइबर सिस्टम के माध्यम से द्विपक्षीय इंट्रा-टेलेएन्सेफेलिक (आईटी) कनेक्शन या ipsilateral कनेक्शन बनाते हैं जो अधिक कारण पिरामिड पथ (पीटी) का गठन करता है। यह भी सुझाव दिया गया है कि आईटी और पीटी-प्रकार के टर्मिनल उनकी रिहाई विशेषताओं और आकार21,22में भिन्न होते हैं । इन आंकड़ों को ध्यान में रखते हुए, कोई भी ग्लूटामेट की हैंडलिंग में कुछ मतभेदों की उम्मीद कर सकता है।
स्ट्रेटम हंटिंगटन की बीमारी (एचडी)5में सबसे अधिक प्रभावित मस्तिष्क क्षेत्र है । मानव एचडी एक गंभीर आनुवंशिक रूप से विरासत में मिला न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है। Q175 माउस मॉडल एचडी के हाइपोकाइनेटिक-कठोर रूप के सेलुलर आधार की जांच करने का अवसर प्रदान करता है, एक ऐसा राज्य जो पार्किंसंस के साथ बहुत आम है। लगभग 1 वर्ष की उम्र से शुरू, होमोज़िगोट Q175 चूहों (HOM) हाइपोकिनेसिया के लक्षण प्रदर्शित करते हैं, जैसा कि खुले मैदान23में आंदोलन के बिना बिताए गए समय को मापने से पता चला है। हेट्रोजिगोट Q175 चूहों (एचएटी) के साथ वर्तमान प्रयोगों ने HOM में देखे गए पिछले मोटर घाटे की पुष्टि की और इसके अलावा, यह पता चला कि देखी गई मोटर घाटे के साथ कॉर्टिकोस्टल सिनैप्टिकटर्मिनल2 केतत्काल आसपास एस्ट्रोसाइटिक एक्सेक्टेटरी अमीनो एसिड ट्रांसपोर्टर 2 प्रोटीन (EAAT2) का स्तर कम था। इसलिए यह परिकल्पना की गई है कि एस्ट्रोसाइटिक ग्लूटामेट तेज होने से25,26से संबंधित सिनेप्स की शिथिलता या हानि भी हो सकती है .
यहां, हम एक नए दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं जो जारी न्यूरोट्रांसमीटर की मात्रा के सापेक्ष एकल सिनेप्स ग्लूटामेट निकासी का मूल्यांकन करने की अनुमति देता है। नए ग्लूटामेट सेंसर iGluयू कोर्टिकोस्टरिटल पिरामिड न्यूरॉन्स में व्यक्त किया गया था । इसे काटालिन टोरोक27 द्वारा विकसित किया गया था और पहले से पेश किए गए उच्च आत्मीयता लेकिन धीमी ग्लूटामेट सेंसर iGluSnFR28के संशोधन का प्रतिनिधित्व करता है। दोनों सेंसर बढ़े हुए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) के डेरिवेटिव हैं। स्पेक्ट्रल और गतिज विशेषताओं के लिए, हेलसा एट अल27देखें । संक्षेप में, iGluu तेजी से डी-एक्टिवेशन काइनेटिक्स के साथ एक कम आत्मीयता सेंसर है और इसलिए विशेष रूप से ग्लूटामेट-रिलीजिंग सिनैप्टिक टर्मिनलों पर ग्लूटामेट क्लीयरेंस का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है। iGluu के विच्छेदन समय स्थिर एक बंद प्रवाह डिवाइस में निर्धारित किया गया था, जो 20 डिग्री सेल्सियस पर 2.1 एमएस के मूल्यसे एक ताऊ प्रदान की है, लेकिन 0.68 एमएस जब 34 डिग्री सेल्सियस27के तापमान के लिए बहिष्कृत. एकल Schaffer संपाश्र्वक टर्मिनलों एक 2-फोटॉन माइक्रोस्कोप के तहत organotypic हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों के CA1 क्षेत्र में सर्पिल लेजर स्कैनिंग के साथ ३४ डिग्री सेल्सियस पर जांच २.७ एमएस के क्षय के एक मतलब समय निरंतर प्रदर्शित ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रयोग सामान्य रुचि का सवाल है – न्यूरोडिज़नरेशन के दौरान निर्भरता और इसके संभावित नुकसान की चिंता है, और हम वृद्ध (>1 वर्ष) चूहों से तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में प्रभावित सिनेप्स की पहचान करने के लिए एक नए ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को CHDI (A-12467), जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (Exc 257/1 और DFG प्रोजेक्ट-आईडी 327654276 – SFB 1315) और चारिट के इंट्राम्यूरल रिसर्च फंड्स द्वारा समर्थित किया गया था। हम के Török, सेंट जॉर्ज, लंदन विश्वविद्यालय, और एन Helassa, लिवरपूल विश्वविद्यालय, iGluयू प्लाज्मिड और कई उपयोगी चर्चा के लिए शुक्रिया अदा करते हैं । डी Betances और ए Schönherr उत्कृष्ट तकनीकी सहायता प्रदान की है ।
Materials
| Stereo microsope | WPI | PZMIII | Precision Stereo Zoom Binocular Microscope |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | Digital Lab New Standard stereotaxic frame |
| High speed drill equipment | Stoelting | 514439V | Foredom K1070 cromoter Kit |
| Injection system | Stoelting | 53311 | Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) |
| Hamilton syringe 5 µl | Hamilton | 87930 | 75RN Syr (26s/51/2) |
| Laser positioning system | Rapp OptoElectronic | UGA-40 | UGA-40 |
| Blue laser for iGluu excitation | Rapp OptoElectronic | DL-473-020-S | 473 nm laser |
| Dichroic mirror for 473 nm | Rapp OptoElectronic | ROE TB-355-405-473 | Dichroic |
| 1P upright microscope | Carl Zeiss | 000000-1066-600 | Axioskop 2 FS Plus |
| Objective 63x/1.0 | Carl Zeiss | 421480-9900 | W Plan-Apochromat |
| 4x objective | Carl Zeiss | 44-00-20 | Achroplan 4x/0,10 |
| Dichroic mirror for iGluu | Omega optical | XF2030 | |
| Emission filter for iGluu | Omega optical | XF3086 | |
| Dichroic mirror | Omega optical | QMAX_DI580LP | |
| Emission filter for autofluorescence subtr. | Omega optical | QMAX EM600-650 | |
| sCMOS camera | Andor | ZYLA4.2PCL10 | ZYLA 4.2MP Plus |
| Acqusition software | Andor | 4.30.30034.0 | Solis |
| AD/DA converter | HEKA Elektronik | 895035 | InstruTECH LIH8+8 |
| Aquisition software | HEKA Elektronik | 895153 | TIDA5.25 |
| Electrode positioning system | Sutter Instrument | MPC-200 | Micromanipulator |
| Electrical stimulator | Charite workshops | STIM-26 | |
| Slicer | Leica | VT1200 S | Vibrotome |
| Brown/Flaming-type puller | Sutter Instr | SU-P1000 | P-1000 |
| Glass tubes for injection pipettes | WPI | 1B100F3 | |
| Glass tubes forstimulation pipettes | WPI | R100-F3 | |
| Tetrodotoxin | Abcam | ab120054 | TTX |
| iGluu plasmid | Addgene | 106122 | pCI-syn-iGluu |
| Q175 mice | Jackson Lab | 27410 | Z-Q175-KI |
References
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
- Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
- Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56 (2018).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
- Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington’s disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
- Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
- Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554 (2018).
- Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
- Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239 (2018).
- Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
- Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
- Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
- Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451 (2018).
- Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
- Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
- Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington’s disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
- Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington’s disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
- Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson’s disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
- Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
- Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
- Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons – dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142 (2010).
- Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. 신경과학. 311, 519-538 (2015).
- Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
- Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington’s disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
- Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
- Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2003).
- Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
- Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
- Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154 (2017).
- Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
- Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality–how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
- Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
- Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
- Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
- Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
- Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
- Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
- Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
- Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, a. O., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
- Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
- Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19 (2019).
- Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
- Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington’s disease mice. Scientific Reports. 9, 6634 (2019).
- Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414 (2019).
- Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
- Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).
