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신경과학

Indicatori di sinapsi singola di Soldamento Release e Uptake in Acute Brain Slices da Topi Normali e Huntington

Published: March 11, 2020
doi:
10.3791/60113
,
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center,Charité – University Medicine

Summary

Presentiamo un protocollo per valutare l’equilibrio tra il rilascio del glutammato e l’autorizzazione alle singole sinapsi glutamatergiche corticosterogiche in fette acute di topi adulti. Questo protocollo utilizza il sensore fluorescente iGluu per il rilevamento del glutammato, una telecamera sCMOS per l’acquisizione del segnale e un dispositivo per l’illuminazione laser focale.

Abstract

Le sinapsi sono unità funzionali altamente compartimentate che operano in modo indipendente l’una sull’altra. Nella malattia di Huntington (HD) e in altri disturbi neurodegenerativi, questa indipendenza potrebbe essere compromessa a causa dell’insufficiente eliminazione del glutammato e dei conseguenti effetti di fuoriuscita e fuoriuscita. Una copertura astrocitica alterata dei terminali pressinaptici e/o delle spine dendritiche, nonché una dimensione ridotta degli ammassi trasportatori di glutammato nei siti di rilascio del glutammato sono state implicate nella patogenesi delle malattie che si sono manifestate sintomi di dis-ipercinesi. Tuttavia, i meccanismi che portano alla disfunzione delle sinapsi glutamategiche nella MH non sono ben compresi. Migliorando e applicando l’imaging a sinapsi abbiamo ottenuto dati che gettano nuova luce sui meccanismi che impediscono l’avvio dei movimenti. Qui, descriviamo gli elementi principali di un approccio relativamente poco costoso per ottenere una risoluzione a sinapsi singola utilizzando il nuovo sensore di glutammato ultraveloce codificato geneticamente iGluu, ottica a campo largo, una telecamera scientifica CMOS (sCMOS), un laser da 473 nm e un sistema di posizionamento laser per valutare lo stato delle sinapsi corticostriatali in fette acute da topi sani o malati appropriati. I transienti glutammati sono stati costruiti da uno o più pixel per ottenere stime del rilascio di i) glutammato in base all’elevazione massima della concentrazione di glutammato [Glu] accanto alla zona attiva e ii) assorbimento del glutammato come riflesso nella costante temporale di decadimento (TauD) del perissitico [Glu]. Le differenze nella dimensione dell’bouton a riposo e nei modelli contrastanti di plasticità a breve termine servivano come criteri per l’identificazione dei terminali corticostalati come appartenenti al percorso intratelencephalico (IT) o al tratto piramidale (PT). Utilizzando questi metodi, abbiamo scoperto che nei topi MH sintomatici il 40% delle sinapsi corticostriatali di tipo PT mostrava una scarsa distanza del glutammato, suggerendo che queste sinapsi potrebbero essere a rischio di danni da eccitotossici. I risultati sottolineano l’utilità del TauD come biomarcatore delle sinapsi disfunzionali nei topi di Huntington con un fenotipo iponetetico.

Introduction

L’impatto relativo di ogni terminale sinaptico appartenente a una “connessione unitaria” (cioè la connessione tra due cellule nervose) è tipicamente valutato dalla sua influenza sul segmento iniziale del neurone post-sinaptico1,2. Le registrazioni somatiche e/o dendritiche dei neuroni post-sinaptici rappresentano le più comuni e, fino ad ora, anche i mezzi più produttivi per chiarire l’elaborazione delle informazioni sotto una prospettiva top-down o verticale3,4,5. Tuttavia, la presenza di astrociti con i loro territori discreti e (in roditori) non sovrapposti può contribuire a una prospettiva orizzontale che si basa su meccanismi locali di scambio di segnale, integrazione e sincronizzazione nei siti sinaptici6,7,8,9,10.

Perché è noto che l’astroglia gioca, in generale, un ruolo importante nella patogenesi della malattia neurodegenerativa11,12 e, in particolare, un ruolo nel mantenimento e plasticità delle sinapsi glutamategiche13,14,15,,16, è concepibile che alterazioni delle prestazioni sinaptiche si evolvono in conformità con lo stato di astrociti nell’area di destinazione condivisa di fibre afferenti di varia origine. Per esplorare ulteriormente i meccanismi normativi locali di origine target/astroglia in materia di salute e malattia, è necessario valutare le singole sinapsi. L’approccio attuale è stato elaborato per stimare la gamma di indicatori funzionali di rilascio e gioco del glutammato e per definire i criteri che possono essere utilizzati per identificare le sinapsi disfunzionali (o recuperate) nelle aree cerebrali più strettamente correlate all’inizio del movimento (cioè, prima di tutto nella corteccia motoria e nello striato dorsale).

Lo striato manca di neuroni glutamatergici intrinseci. Pertanto, è relativamente facile identificare gli afferenti glutamatergici di origine extrastriata. Questi ultimi hanno per lo più origine nel talamo mediale e nella corteccia cerebrale (vedi17,18,19,20 per di più). Le sinapsi corticostriatali sono formate dagli assoni dei neuroni piramidali localizzati negli strati corticali 2/3 e 5. I rispettivi assoni formano connessioni bilaterali intratelefila (IT) o connessioni ipsilaterali attraverso un sistema in fibra che costituisce più caudalmente il tratto piramidale (PT). È stato inoltre suggerito che i terminali di tipo IT e PT differiscono per le loro caratteristiche di rilascio e dimensione21,22. Alla luce di questi dati, ci si potrebbe aspettare anche alcune differenze nella gestione del glutammato.

Lo striato è l’area cerebrale più colpita nella malattia di Huntington (HD)5. La MH umana è un grave disturbo neurodegenerativo geneticamente ereditato. Il modello murino Q175 offre l’opportunità di studiare la base cellulare della forma ipocinetica-rigida della MH, uno stato che ha molto in comune con il parkinsonismo. A partire da un’età di circa 1 anno, i topi omozigote Q175 (HOM) presentano segni di ipocinesia, come rivelato misurando il tempo trascorso senza movimento in un campo aperto23. I presenti esperimenti con topi eterozigote Q175 (HET) hanno confermato i precedenti deficit motori osservati nell’HOM e, inoltre, hanno dimostrato che i deficit motori osservati sono stati accompagnati da un livello ridotto dell’amminoacido eccitativo astrocitatorio trasportatore 2 proteine (EAAT2) nelle immediate vicinanze dei terminali sinaptici corticostriali24. È stato quindi ipotizzato che un deficit nell’assorbimento del glutammato astrocitico potrebbe portare a disfunzione o addirittura alla perdita delle rispettive sinapsi25,26.

Qui, descriviamo un nuovo approccio che permette di valutare l’autorizzazione del glutammato a sinapsi singola rispetto alla quantità del neurotrasmettitore rilasciato. Il nuovo sensore di glutammato iGluu è stato espresso nei neuroni piramidali corticostriatali. È stato sviluppato da Katalin T’r’k27 e rappresenta una modifica del sensore ad alta affinità ma lento del glutammato iGluSnFR28introdotto in precedenza. Entrambi i sensori sono derivati della proteina fluorescente verde potenziata (EGFP). Per le caratteristiche spettrali e cinetiche, vedere Helassa et al.27. In breve, iGluu è un sensore a bassa affinità con cinetica di deattivazione rapida e quindi particolarmente adatto per studiare l’autorizzazione del glutammato nei terminali sinaptici che rilasciano glutammato. La costante del tempo di dissociazione di iGluu è stata determinata in un dispositivo di arresto del flusso, che ha reso un valore di spegnimento di Tau di 2,1 ms a 20 , ma 0,68 ms quando estrapolato ad una temperatura di 34 .off 27 I singoli terminali collaterali di Schaffer sondati a 34 gradi centigradi con la scansione a spirale nella regione CA1 delle colture organotipiche dell’ippocampo sotto un microscopio a 2 fotoni hanno mostrato una costante temporale media di decadimento di 2,7 ms.

Protocol

Tutti i lavori sono stati effettuati in conformità con la direttiva UE 2010/63/EU per esperimenti sugli animali ed è stato registrato presso l’Ufficio di Berlino per la protezione della salute e la sicurezza tecnica (G0233/14 e G0218/17). NOTA: le registrazioni da Q175 wild-type (WT) ed heterozygotes (HET) possono essere eseguite a qualsiasi età e sesso. Qui abbiamo studiato maschi e femmine all’età di 51-76 settimane. 1. Iniezione del Sensore Glutamate i…

Representative Results

Identificazione di due tipi di glutamatesità corticostriataliGli afferenti IT e PT hanno origine rispettivamente nei livelli 2/3 e 5 e presentano modelli di ramificazione e terminazione differenziali nello striato ipsilaterale e contralaterale (solo terminali IT). Si sa ancora poco sulle proprietà del rilascio e della clearance del glutammato in condizioni ripetitive di attivazione osservate durante l’avvio dei movimenti, ma è ben documentato che le rispettive varietà di rilascio del glutammato d…

Discussion

Gli esperimenti riguardano una questione di interesse generale : l’indipendenza da sinapsi e la sua possibile perdita nel corso della neurodegenerazione, e descriviamo un nuovo approccio per identificare le sinapsi colpite nelle fette cerebrali acute da topi invecchiati (>1 anno). Approfittando delle caratteristiche cinetiche migliorate del sensore di glutammato recentemente introdotto iGluu, gli esperimenti illuminano la relazione tra il rilascio e l’assorbimento del glutammato sinaptico in un modo che prima …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da CHDI (A-12467), dalla Fondazione tedesca per la ricerca (Exc 257/1 e dal progetto-ID DFG 327654276 – SFB 1315) e dai fondi di ricerca intramurali della Charité. Ringraziamo K. T’r’k, St. George’s, Università di Londra, e N. Helassa, Università di Liverpool, per l’iGluu plasmid e molte discussioni utili. D. Betances e A. Schànherr hanno fornito un’eccellente assistenza tecnica.

Materials

Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI
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References

  1. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
  2. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
  3. Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56 (2018).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
  5. Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington’s disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
  6. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
  7. Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
  8. Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554 (2018).
  9. Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
  10. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239 (2018).
  11. Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
  12. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
  13. Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
  14. Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451 (2018).
  15. Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
  16. Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
  17. Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington’s disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
  18. Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington’s disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
  19. Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson’s disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
  20. Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
  21. Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
  22. Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons – dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142 (2010).
  23. Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. 신경과학. 311, 519-538 (2015).
  24. Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
  25. Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington’s disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
  26. Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
  27. Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
  28. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
  29. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2003).
  30. Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
  31. Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
  32. Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154 (2017).
  33. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
  34. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality–how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  35. Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
  36. Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
  37. Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
  38. Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
  39. Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
  40. Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
  41. Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
  42. Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, a. O., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
  43. Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
  44. Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19 (2019).
  45. Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
  46. Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington’s disease mice. Scientific Reports. 9, 6634 (2019).
  47. Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414 (2019).
  48. Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
  49. Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).

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Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).
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