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Abstract
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신경과학

正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標

Published: March 11, 2020
doi:
10.3791/60113
,
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center,Charité – University Medicine

Summary

我々は、単一のコルチコストリアタールグルタミン酸シナプスにおけるグルタミン酸放出とクリアランスのバランスを、成体マウスからの急性スライスにおける評価するプロトコルを提示する。このプロトコルは、グルタミン酸検出用の蛍光センサ iGluu、信号取得用のsCMOSカメラ、焦点レーザー照明装置を使用します。

Abstract

シナプスは、互いに独立して動作する高度に区画化された機能ユニットです。ハンチントン病(HD)および他の神経変性疾患では、グルタミン酸クリアランスの不十分さと結果として生じる流出および流出効果のために、この独立性が損なわれる可能性がある。シナプス前の末端および/または樹状脊椎の変わった占星術のカバレッジ、ならびにグルタミン酸放出部位におけるグルタミン酸輸送体の減少サイズは、疾患の病因に関与しており、その結果、異症/高キネジーの症状が生じる。しかし、HDにおけるグルタミン酸シナプスの機能障害につながるメカニズムはよく理解されていない。シナプスイメージングの改善と応用により、動きの開始を妨げるメカニズムに新たな光を当てるデータを得ました。ここでは、新しい遺伝子でコード化された超高速グルタミン酸センサーiGluu、広視野光学、科学CMOS(sCMOS)カメラ、473 nmレーザー、およびレーザー測位システムを使用して、適切な健康または病気の疾患の年齢から急性の皮質コストリアタールシナプスの状態を評価することによって、単一シナプス分解能を達成するための比較的安価なアプローチの原理要素を説明する。グルタミン酸過渡は、単一または複数のピクセルから構築され、i)グルタミン酸濃度の最大上昇に基づいてi)グルタミン酸放出が活性領域とiiの隣にあるグルタミン酸濃度[Glu]の時間定数(TauD)に反映されるように構築された[Glu]。短期可塑性の安静ブブトンサイズと対照パターンの違いは、子宮内脳症(IT)または錐管(PT)経路に属するコルチコストリアタール末端の同定の基準として役立った。これらの方法を用いて、症状のあるHDマウスではPT型コルチコストリアタールシナプスの40%がグルタミン酸クリアランスが不十分であることを発見し、これらのシナプスが興奮性損傷の危険にさらされる可能性があることを示唆した。この結果は、虚血性表現型を有するハンチントンマウスにおける機能不全シナプスのバイオマーカーとしてのTauDの有用性を強調した。

Introduction

「単一接続」に属する各シナプス末端の相対的な影響(すなわち、2つの神経細胞間の接続)は、典型的には、心内ナプティックニューロン11,22の初期セグメントに対するその影響によって評価される。ポストナプティクスニューロンからの体細胞および/または樹状記録は、最も一般的であり、これまで、トップダウンまたは垂直の視点33、4、54,5の下で情報処理を明確にする最も生産的な手段でもあります。しかし、それらの離散領域と(げっ歯類)非重なり合う領域を持つアストロサイトの存在,は、シナプス部位6、7、8、9、107における信号交換、統合9,10および同期6の局所メカニズムに基づく水平視点を寄与し得る。8

アストログリアが遊ぶことが知られているので、一般的に、神経変性疾患11、12,12および、特に、グルタマテル作動性シナプス13、14、15、1614,の維持および可塑性における役割13は、シナプス性の変化が多様な対象の線維の中でアストロシンの状態に応じて進化することが考えられる。15,16さらに、健康と病気における標的/アストログリア由来の局所調節機構を調べるには、個々のシナプスを評価する必要があります。本手法は、機能性グルタミン酸放出およびクリアランス指標の範囲を推定し、運動開始に最も密接に関連する脳領域における機能不全(または回収)シナプスを同定するために使用できる基準を定義するために働いた(すなわち、まず運動皮質および側側線条体の中で)。

線条体は、固有のグルタミン酸細胞系ニューロンを欠いている。したがって、他の起源のグルタマテルゲン酸凝集剤を比較的容易に同定することが容易である。後者は主に内側視床と大脳皮質に由来する(詳細については17、18、19、2018,19,20参照)。17コルチコストリアスシナプスは、皮質層2/3および5に局在する錐体ニューロンの軸索によって形成される。それぞれの軸索は、錐体管(PT)をより大きく構成する繊維系を介して、両側のテレンスファリック内(IT)接続またはipsilater接続を形成する。さらに、IT型およびPT型端末は、リリース特性とサイズ21、22,22が異なることを示唆している。これらのデータを考慮すると、グルタミン酸の取り扱いに若干の違いがあると考えることもできます。

線条体はハンチントン病(HD)5で最も影響を受けた脳5領域である。ヒトHDは、重度の遺伝的に遺伝する神経変性疾患である。Q175マウスモデルは、パーキンソニズムと多くの共通点を持つHDの低運動リジッド形態の細胞基盤を調査する機会を提供する。約1年齢から、ホモザイゴテQ175マウス(HOM)は、低血圧の徴候を示し、開場23で動かずに過ごした時間を測定することによって明らかになる。本実験では、ヘテロジゴテQ175マウス(HET)は、HOMで観察された以前の運動障害を確認し、さらに、観察された運動障害は、皮質化基底シナプス末端部24の近傍における占星興奮性アミノ酸トランスポーター2タンパク質(EAAT2)の減少レベルを伴っていることを示した。したがって、占星グルタミン酸の取り込みの赤字は、機能不全またはそれぞれのシナプス25、26,26の損失につながる可能性があると仮定されています。

ここでは、放出された神経伝達物質の量に対して単一シナプスグルタミン酸クリアランスを評価することを可能にする新しいアプローチを説明する。新しいグルタミン酸センサー iGluuは、コルチコストリアタール錐体のニューロンで発現した。それはカタリン・トレック27によって開発され、以前に導入された高親和性が遅いグルタミン酸センサーiGluSnFR28の修飾を表す。両方のセンサーは、強化された緑色蛍光タンパク質(EGFP)の誘導体です。スペクトル特性および運動特性については、Helassaら27を参照してください。簡単に言えば、iGluuは急速な脱活性化動態を備えた低親和性センサーであり、したがってグルタミン酸放出シナプス末端におけるグルタミン酸クリアランスを研究するのに特に適している。iGluuの解離時定数は停止流れ装置で決定され、タウオフ値は20°Cで2.1ms、34°C27の温度に外挿すると0.68msとなった。272光子顕微鏡下でのORGAnotypichippoカンピカル培養のCA1領域におけるスパイラルレーザースキャンを用いて34°Cで探査された単一のシャファー担保端子は、2.7msの平均時反減衰を示した。

Protocol

すべての作業は、動物実験のためのEU指令2010/63/EUに従って行われており、ベルリン健康保護技術安全局(G0233/14およびG0218/17)に登録されました。 注:Q175ワイルドタイプ(WT)とヘテロ接合体(HET)からの録音は、任意の年齢と性別で行うことができます。ここでは、51〜76週の年齢で男性と女性を研究しました。 1. コルティコストリアタール軸索におけ?…

Representative Results

2種類のコルチコストリアタール酸筋性静脈瘤の同定IT および PT の afferent は、それぞれレイヤ 2/3 と 5 に由来し、イプシラショナルおよび逆側 (IT 端末のみ) 線条体に差異的な影響と終了パターンを示します。運動の開始の間に観察される反復的な活性化条件下でのグルタミン酸放出およびクリアランスの特性についてはまだほとんど知られていないが、それぞれのグルタミン?…

Discussion

実験は、シナプス依存性と神経変性の過程におけるシナプスの損失の可能性という一般的な関心の問題に関するものであり、我々は、老化した(>1年)マウスからの急性脳切片の影響を受けたシナプスを同定するための新しいアプローチを記述する。最近導入されたグルタミン酸センサiGluuの改善された運動特性を利用して、シナプスグルタミン酸放出と取り込みとの関係を以前は不可?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、CHDI(A-12467)、ドイツ研究財団(Exc 257/1およびDFGプロジェクトID 327654276 – SFB 1315)、シャリテの壁内研究基金によって支援されました。K.テレク、セントジョージズ、ロンドン大学、N.ヘラッサ(リバプール大学)に感謝します。uD.ベタンスとA.シェーンヘルは優れた技術支援を提供しました。

Materials

Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI
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References

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Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).
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