Vi presenterar ett protokoll för att utvärdera balansen mellan glutamat release och clearance vid enstaka korticostriatal glutamatergic synapser i akuta skivor från vuxna möss. Detta protokoll använder fluorescerande sensor iGluu för glutamat upptäckt, en sCMOS-kamera för signalförvärv och en enhet för fokal laserbelysning.
Synapser är mycket uppdelade funktionella enheter som fungerar oberoende av varandra. Vid Huntingtons sjukdom (HS) och andra neurodegenerativa sjukdomar kan detta oberoende äventyras på grund av otillräcklig glutamat clearance och de resulterande spridnings- och utspillningseffekterna. Förändrad astrocytisk täckning av presynaptiska terminaler och/eller dendritiska ryggar samt en minskad storlek på glutamat transportör kluster på glutamat release platser har varit inblandad i patogenesen vid sjukdomar som resulterar i symtom på dys-/hyperkinesi. Men de mekanismer som leder till dysfunktion av glutamaterga synapser i HS är inte väl förstådda. Förbättra och tillämpa synapse imaging vi har fått data sprider nytt ljus över de mekanismer som hindrar inledandet av rörelser. Här beskriver vi de viktigaste inslagen i en relativt billig metod för att uppnå en enda synaps upplösning genom att använda den nya genetiskt kodade ultrasnabba glutamat sensor iGluu, wide-field optik, en vetenskaplig CMOS (sCMOS) kamera, en 473 nm laser och en laser positioneringssystem för att utvärdera tillståndet för korticostriatal synapser i akuta skivor från ålder lämpliga friska eller sjuka möss. Glutamat transienter konstruerades från enstaka eller flera pixlar för att få uppskattningar av i) glutamat release baserat på den maximala höjden av glutamat koncentrationen [Glu] bredvid den aktiva zonen och ii) glutamat upptag som återspeglas i tidkonstanten av förfall (TauD) av perisynaptic [Glu]. Skillnader i vilande bouton storlek och kontrasterande mönster av kortsiktiga plasticitet fungerat som kriterier för identifiering av korticostriatal terminaler som tillhör intratelencephalic (IT) eller pyramidala tarmkanalen (PT) väg. Med hjälp av dessa metoder upptäckte vi att i symptomatiska HS möss ~ 40% av PT-typ korticostriatal synapser uppvisade otillräcklig glutamat clearance, vilket tyder på att dessa synapser kan vara i riskzonen för excitotoxic skador. Resultaten understryker taud:s användbarhet som biomarkör för dysfunktionella synapser hos Huntington-möss med en hypokinetisk fenotyp.
Den relativa effekten av varje synaptisk terminal som tillhör en “enhetlig anslutning” (dvs. sambandet mellan 2 nervceller) bedöms vanligtvis av dess påverkan på det ursprungliga segmentet av den postsynaptiska neuron1,2. Somatiska och/eller dendritiska inspelningar från postsynaptiska nervceller representerar de vanligaste och hittills också det mest produktiva sättet att klargöra informationsbehandling under ett uppifrån och ner eller vertikalt perspektiv3,4,5. Förekomsten av astrocyter med deras diskreta och (hos gnagare) icke-överlappande territorier kan dock bidra med ett horisontellt perspektiv som bygger på lokala mekanismer för signalutbyte, integration och synkronisering vid synaptiska platser6,7,8,99,10.
Eftersom det är känt att astroglia spelar, i allmänhet, en viktig roll i patogenesen vid neurodegenerativ sjukdom11,12 och i synnerhet en roll i underhåll och plasticitet av glutamaterga synapser13,14,1515,16, är det tänkbart att förändringar i synaptisk prestanda utvecklas i enlighet med tillståndet av astrocyter i det gemensamma målområdet för afferent fibrer med olika ursprung. För att ytterligare utforska de mål-/astroglia-härledda lokala regleringsmekanismerna vid hälsa och sjukdom är det nödvändigt att utvärdera enskilda synapser. Den nuvarande metoden utarbetades för att uppskatta utbudet av funktionella glutamat release och clearance indikatorer och att definiera kriterier som kan användas för att identifiera dysfunktionella (eller återvunna) synapser i hjärnan områden som är närmast relaterade till rörelse inledande (dvs. först och främst i motor cortex och dorsala striatum).
Striatum saknar inneboende glutamatergic nervceller. Därför är det relativt lätt att identifiera glutamaterga afferents av extrastriatal ursprung. Den senare har mestadels sitt ursprung i den mediala talamus och i hjärnbarken (se17,18,19,20 för mer). Korticostriatal synapser bildas av axoner av pyramidala nervceller lokaliserade i när lager 2/3 och 5. Respektive axoner bildar bilaterala anslutningar inom telencephalic (IT) eller ensidiga anslutningar via ett fibersystem som mer caudally utgör pyramidala tarmkanalen (PT). Det har vidare föreslagits att TERMINALER av IT- och PT-typ skiljer sig åt i sina utgivningsegenskaper och storlek21,,22. Med tanke på dessa uppgifter kan man också förvänta sig vissa skillnader i hanteringen av glutamat.
Striatum är det mest drabbade hjärnområdet vid Huntingtons sjukdom (HS)5. Human Hd är en allvarlig genetiskt ärftlig neurodegenerativ sjukdom. Q175 musmodellen erbjuder en möjlighet att undersöka den cellulära grunden för den hypokinetiska styva formen av HS, ett tillstånd som har mycket gemensamt med parkinsonism. Från en ålder av ca 1 år, homozygotQ175 möss (HOM) uppvisar tecken på hypokinesi, vilket framgår av att mäta den tid som tillbringas utan rörelse i ett öppet fält23. De nuvarande experimenten med heterozygotq175 möss (HET) bekräftade de tidigare motorunderskott som observerats i HOM och visade dessutom att de observerade motorunderskotten åtföljdes av en reducerad nivå av astrocytic excitatoriska aminosyratransportören 2 protein (EAAT2) i omedelbar närhet av korticostriatal synaptiska terminaler24. Det har därför varit en hypotes om att ett underskott i astrocytic glutamat upptag kan leda till dysfunktion eller till och med förlust av respektive synapser25,26.
Här beskriver vi en ny metod som gör det möjligt för en att utvärdera enstaka synaps glutamat clearance i förhållande till mängden av den frigjorda signalsubstansen. Den nya glutamat sensor iGluu uttrycktes i korticostriatal pyramidal nervceller. Det har utvecklats av Katalin Török27 och representerar en ändring av den tidigare introducerade hög-affinitet men långsam glutamat sensor iGluSnFR28. Båda sensorerna är derivat av det förstärkta gröna fluorescerande proteinet (EGFP). För spektrala och kinetiska egenskaper, se Helassa et al.27. Kort, iGluu är en låg affinitet sensor med snabb de-aktivering kinetik och därför särskilt väl lämpad att studera glutamat clearance på glutamat-släppa synaptiska terminaler. Dissociationstidskonstanten för iGluu fastställdes i en stoppad flödesanordning, vilket gjorde en Tauav värde på 2,1 ms vid 20 °C, men 0,68 ms när extrapoleras till en temperatur på 34 °C27. Single Schaffer säkerheter terminaler sonderade vid 34 °C med spiral laser scanning i CA1 regionen organotypic hippocampus kulturer under en 2-fotonmikroskop uppvisade en genomsnittlig tid konstant av förfall på 2,7 ms.
Experimenten handlar om en fråga av allmänt intresse – synapsberoende och dess eventuella förlust under neurodegeneration, och vi beskriver en ny metod för att identifiera drabbade synapser i akuta hjärnskivor från äldre (>1 år) möss. Dra nytta av de förbättrade kinetiska egenskaperna hos den nyligen introducerade glutamat sensor iGluu experimenten belysa förhållandet mellan synaptisk glutamat release och upptag på ett sätt som inte har varit möjligt tidigare.
Påv…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av CHDI (A-12467), Den tyska forskningsstiftelsen (Exc 257/1 och DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) och intramural forskningsfonder i Charité. Vi tackar K. Török, St George’s, University of London, och N. Helassa, University of Liverpool, för iGluu plasmid och många hjälpsamma diskussioner. D. Betances och A. Schönherr gav utmärkt teknisk hjälp.
Stereo microsope | WPI | PZMIII | Precision Stereo Zoom Binocular Microscope |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | Digital Lab New Standard stereotaxic frame |
High speed drill equipment | Stoelting | 514439V | Foredom K1070 cromoter Kit |
Injection system | Stoelting | 53311 | Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) |
Hamilton syringe 5 µl | Hamilton | 87930 | 75RN Syr (26s/51/2) |
Laser positioning system | Rapp OptoElectronic | UGA-40 | UGA-40 |
Blue laser for iGluu excitation | Rapp OptoElectronic | DL-473-020-S | 473 nm laser |
Dichroic mirror for 473 nm | Rapp OptoElectronic | ROE TB-355-405-473 | Dichroic |
1P upright microscope | Carl Zeiss | 000000-1066-600 | Axioskop 2 FS Plus |
Objective 63x/1.0 | Carl Zeiss | 421480-9900 | W Plan-Apochromat |
4x objective | Carl Zeiss | 44-00-20 | Achroplan 4x/0,10 |
Dichroic mirror for iGluu | Omega optical | XF2030 | |
Emission filter for iGluu | Omega optical | XF3086 | |
Dichroic mirror | Omega optical | QMAX_DI580LP | |
Emission filter for autofluorescence subtr. | Omega optical | QMAX EM600-650 | |
sCMOS camera | Andor | ZYLA4.2PCL10 | ZYLA 4.2MP Plus |
Acqusition software | Andor | 4.30.30034.0 | Solis |
AD/DA converter | HEKA Elektronik | 895035 | InstruTECH LIH8+8 |
Aquisition software | HEKA Elektronik | 895153 | TIDA5.25 |
Electrode positioning system | Sutter Instrument | MPC-200 | Micromanipulator |
Electrical stimulator | Charite workshops | STIM-26 | |
Slicer | Leica | VT1200 S | Vibrotome |
Brown/Flaming-type puller | Sutter Instr | SU-P1000 | P-1000 |
Glass tubes for injection pipettes | WPI | 1B100F3 | |
Glass tubes forstimulation pipettes | WPI | R100-F3 | |
Tetrodotoxin | Abcam | ab120054 | TTX |
iGluu plasmid | Addgene | 106122 | pCI-syn-iGluu |
Q175 mice | Jackson Lab | 27410 | Z-Q175-KI |