JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

Enda synaps indikatorer på glutamat release och upptag i akut hjärnskivor från normala och Huntington Möss

Published: March 11, 2020
doi:
10.3791/60113
,
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center,Charité – University Medicine

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att utvärdera balansen mellan glutamat release och clearance vid enstaka korticostriatal glutamatergic synapser i akuta skivor från vuxna möss. Detta protokoll använder fluorescerande sensor iGluu för glutamat upptäckt, en sCMOS-kamera för signalförvärv och en enhet för fokal laserbelysning.

Abstract

Synapser är mycket uppdelade funktionella enheter som fungerar oberoende av varandra. Vid Huntingtons sjukdom (HS) och andra neurodegenerativa sjukdomar kan detta oberoende äventyras på grund av otillräcklig glutamat clearance och de resulterande spridnings- och utspillningseffekterna. Förändrad astrocytisk täckning av presynaptiska terminaler och/eller dendritiska ryggar samt en minskad storlek på glutamat transportör kluster på glutamat release platser har varit inblandad i patogenesen vid sjukdomar som resulterar i symtom på dys-/hyperkinesi. Men de mekanismer som leder till dysfunktion av glutamaterga synapser i HS är inte väl förstådda. Förbättra och tillämpa synapse imaging vi har fått data sprider nytt ljus över de mekanismer som hindrar inledandet av rörelser. Här beskriver vi de viktigaste inslagen i en relativt billig metod för att uppnå en enda synaps upplösning genom att använda den nya genetiskt kodade ultrasnabba glutamat sensor iGluu, wide-field optik, en vetenskaplig CMOS (sCMOS) kamera, en 473 nm laser och en laser positioneringssystem för att utvärdera tillståndet för korticostriatal synapser i akuta skivor från ålder lämpliga friska eller sjuka möss. Glutamat transienter konstruerades från enstaka eller flera pixlar för att få uppskattningar av i) glutamat release baserat på den maximala höjden av glutamat koncentrationen [Glu] bredvid den aktiva zonen och ii) glutamat upptag som återspeglas i tidkonstanten av förfall (TauD) av perisynaptic [Glu]. Skillnader i vilande bouton storlek och kontrasterande mönster av kortsiktiga plasticitet fungerat som kriterier för identifiering av korticostriatal terminaler som tillhör intratelencephalic (IT) eller pyramidala tarmkanalen (PT) väg. Med hjälp av dessa metoder upptäckte vi att i symptomatiska HS möss ~ 40% av PT-typ korticostriatal synapser uppvisade otillräcklig glutamat clearance, vilket tyder på att dessa synapser kan vara i riskzonen för excitotoxic skador. Resultaten understryker taud:s användbarhet som biomarkör för dysfunktionella synapser hos Huntington-möss med en hypokinetisk fenotyp.

Introduction

Den relativa effekten av varje synaptisk terminal som tillhör en “enhetlig anslutning” (dvs. sambandet mellan 2 nervceller) bedöms vanligtvis av dess påverkan på det ursprungliga segmentet av den postsynaptiska neuron1,2. Somatiska och/eller dendritiska inspelningar från postsynaptiska nervceller representerar de vanligaste och hittills också det mest produktiva sättet att klargöra informationsbehandling under ett uppifrån och ner eller vertikalt perspektiv3,4,5. Förekomsten av astrocyter med deras diskreta och (hos gnagare) icke-överlappande territorier kan dock bidra med ett horisontellt perspektiv som bygger på lokala mekanismer för signalutbyte, integration och synkronisering vid synaptiska platser6,7,8,99,10.

Eftersom det är känt att astroglia spelar, i allmänhet, en viktig roll i patogenesen vid neurodegenerativ sjukdom11,12 och i synnerhet en roll i underhåll och plasticitet av glutamaterga synapser13,14,1515,16, är det tänkbart att förändringar i synaptisk prestanda utvecklas i enlighet med tillståndet av astrocyter i det gemensamma målområdet för afferent fibrer med olika ursprung. För att ytterligare utforska de mål-/astroglia-härledda lokala regleringsmekanismerna vid hälsa och sjukdom är det nödvändigt att utvärdera enskilda synapser. Den nuvarande metoden utarbetades för att uppskatta utbudet av funktionella glutamat release och clearance indikatorer och att definiera kriterier som kan användas för att identifiera dysfunktionella (eller återvunna) synapser i hjärnan områden som är närmast relaterade till rörelse inledande (dvs. först och främst i motor cortex och dorsala striatum).

Striatum saknar inneboende glutamatergic nervceller. Därför är det relativt lätt att identifiera glutamaterga afferents av extrastriatal ursprung. Den senare har mestadels sitt ursprung i den mediala talamus och i hjärnbarken (se17,18,19,20 för mer). Korticostriatal synapser bildas av axoner av pyramidala nervceller lokaliserade i när lager 2/3 och 5. Respektive axoner bildar bilaterala anslutningar inom telencephalic (IT) eller ensidiga anslutningar via ett fibersystem som mer caudally utgör pyramidala tarmkanalen (PT). Det har vidare föreslagits att TERMINALER av IT- och PT-typ skiljer sig åt i sina utgivningsegenskaper och storlek21,,22. Med tanke på dessa uppgifter kan man också förvänta sig vissa skillnader i hanteringen av glutamat.

Striatum är det mest drabbade hjärnområdet vid Huntingtons sjukdom (HS)5. Human Hd är en allvarlig genetiskt ärftlig neurodegenerativ sjukdom. Q175 musmodellen erbjuder en möjlighet att undersöka den cellulära grunden för den hypokinetiska styva formen av HS, ett tillstånd som har mycket gemensamt med parkinsonism. Från en ålder av ca 1 år, homozygotQ175 möss (HOM) uppvisar tecken på hypokinesi, vilket framgår av att mäta den tid som tillbringas utan rörelse i ett öppet fält23. De nuvarande experimenten med heterozygotq175 möss (HET) bekräftade de tidigare motorunderskott som observerats i HOM och visade dessutom att de observerade motorunderskotten åtföljdes av en reducerad nivå av astrocytic excitatoriska aminosyratransportören 2 protein (EAAT2) i omedelbar närhet av korticostriatal synaptiska terminaler24. Det har därför varit en hypotes om att ett underskott i astrocytic glutamat upptag kan leda till dysfunktion eller till och med förlust av respektive synapser25,26.

Här beskriver vi en ny metod som gör det möjligt för en att utvärdera enstaka synaps glutamat clearance i förhållande till mängden av den frigjorda signalsubstansen. Den nya glutamat sensor iGluu uttrycktes i korticostriatal pyramidal nervceller. Det har utvecklats av Katalin Török27 och representerar en ändring av den tidigare introducerade hög-affinitet men långsam glutamat sensor iGluSnFR28. Båda sensorerna är derivat av det förstärkta gröna fluorescerande proteinet (EGFP). För spektrala och kinetiska egenskaper, se Helassa et al.27. Kort, iGluu är en låg affinitet sensor med snabb de-aktivering kinetik och därför särskilt väl lämpad att studera glutamat clearance på glutamat-släppa synaptiska terminaler. Dissociationstidskonstanten för iGluu fastställdes i en stoppad flödesanordning, vilket gjorde en Tauav värde på 2,1 ms vid 20 °C, men 0,68 ms när extrapoleras till en temperatur på 34 °C27. Single Schaffer säkerheter terminaler sonderade vid 34 °C med spiral laser scanning i CA1 regionen organotypic hippocampus kulturer under en 2-fotonmikroskop uppvisade en genomsnittlig tid konstant av förfall på 2,7 ms.

Protocol

Allt arbete har utförts i enlighet med EU-direktiv 2010/63/EU för djurförsök och registrerades vid Kontoret för skydd av marknaden för hälsa och teknisk säkerhet (G0233/14 och G0218/17). OBS: Inspelningar från Q175 wild-type (WT) och heterozygotes (HETs) kan utföras i alla åldrar och kön. Här studerade vi män och kvinnor vid en ålder av 51 till 76 veckor. 1. Injektion av glutamatsensorn iGluu för uttryck i Korticostriatal A…

Representative Results

Identifiering av två typer av korticostriatal glutamatergic varicositiesIT- och PT-afferents har sitt ursprung i lager 2/3 respektive 5, och uppvisar differentialförgreningar och termineringsmönster i den ensidiga och kontralaterala (endast IT-terminaler) striatum. Fortfarande lite är känt om egenskaperna hos glutamat release och clearance under repetitiva aktiveringsförhållanden som observerats under inledandet av rörelser, men det är väl dokumenterat att respektive glutamat-släppa varico…

Discussion

Experimenten handlar om en fråga av allmänt intresse – synapsberoende och dess eventuella förlust under neurodegeneration, och vi beskriver en ny metod för att identifiera drabbade synapser i akuta hjärnskivor från äldre (>1 år) möss. Dra nytta av de förbättrade kinetiska egenskaperna hos den nyligen introducerade glutamat sensor iGluu experimenten belysa förhållandet mellan synaptisk glutamat release och upptag på ett sätt som inte har varit möjligt tidigare.

Påv…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av CHDI (A-12467), Den tyska forskningsstiftelsen (Exc 257/1 och DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) och intramural forskningsfonder i Charité. Vi tackar K. Török, St George’s, University of London, och N. Helassa, University of Liverpool, för iGluu plasmid och många hjälpsamma diskussioner. D. Betances och A. Schönherr gav utmärkt teknisk hjälp.

Materials

Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
  2. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
  3. Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56 (2018).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
  5. Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington’s disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
  6. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
  7. Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
  8. Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554 (2018).
  9. Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
  10. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239 (2018).
  11. Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
  12. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
  13. Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
  14. Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451 (2018).
  15. Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
  16. Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
  17. Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington’s disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
  18. Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington’s disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
  19. Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson’s disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
  20. Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
  21. Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
  22. Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons – dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142 (2010).
  23. Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. 신경과학. 311, 519-538 (2015).
  24. Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
  25. Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington’s disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
  26. Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
  27. Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
  28. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
  29. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2003).
  30. Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
  31. Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
  32. Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154 (2017).
  33. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
  34. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality–how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  35. Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
  36. Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
  37. Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
  38. Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
  39. Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
  40. Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
  41. Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
  42. Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, a. O., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
  43. Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
  44. Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19 (2019).
  45. Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
  46. Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington’s disease mice. Scientific Reports. 9, 6634 (2019).
  47. Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414 (2019).
  48. Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
  49. Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).

Tags

Single SynapseGlutamate ReleaseGlutamate UptakeAcute Brain SlicesHuntington MiceOne-photon MicroscopeAutofluorescence CorrectionDorsal StriatumStimulation PipetteAction Potential Dependent ReleaseIon Channel BlockersMembrane ReceptorsTetrototoxin
check_url/kr/60113?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image