Um modelo de furão de inflamação sensibilizada tardia preterm-isquêmica lesão cerebral
Summary
O método descreve inflamação sensibilizada hicóxico-isquêmica e lesão cerebral hiperoxica no furão P17 para modelar a interação complexa entre inflamação prolongada e lesão cerebral oxidativa experimentada em um número de bebês prematuros tardios.
Abstract
Há uma necessidade contínua de modelos clinicamente relevantes de infecção perinatal e hipóxia-isquemia (EI), nos quais testar intervenções terapêuticas para bebês com as sequelas neurológicas da prematuridade. Furões são candidatos ideais para modelar o cérebro humano prematuro, como eles nascem lissencefálicos e desenvolver cérebros gironcfálicos pós-natal. Ao nascer, o desenvolvimento do cérebro de furão é semelhante a um feto humano de 13 semanas, com kits pós-natais (P) 17 considerados equivalentes a uma criança de 32 a 36 semanas de gestação. Descrevemos um modelo de lesão no furão P17, onde a administração de lipopolissacarídeos é seguida por isquemia cerebral bilateral, hipóxia e hiperoxia. Isso simula a interação complexa de inflamação prolongada, isquemia, hipóxia e estresse oxidativo experimentado em vários neonatos que desenvolvem lesão cerebral. Os animais feridos exibem uma série de gravidade da lesão bruta, com alterações morfológicas no cérebro, incluindo o estreitamento de vários giros corticais e sulci associados. Animais feridos também mostram desenvolvimento reflexo retardado, velocidade mais lenta e variável de locomoção em uma passarela automatizada, e diminuição da exploração em um campo aberto. Este modelo fornece uma plataforma para testar terapias putativas para lactentes com encefalopatia neonatal associada à inflamação e Hi, mecanismos de estudo de lesões que afetam o desenvolvimento cortical e investigar caminhos que fornecem resiliência animais não afetados.
Introduction
Há uma necessidade contínua de grandes modelos animais que reflitam a fisiopatologia da prematuridade e da hipóxia-isquemia perinatal em que intervenções terapêuticas para bebês podem ser testadas. Em 2017, 9,93% dos 382.726 lactentes nascidos nos Estados Unidos nasceram prematuros e 84% desses bebês nasceram entre 32 e 36 semanas de gestação1. Em prematuros, a exposição perinnatal à infecção ou inflamação é comum, onde a ativação imune materna devido a patógenos virais ou bacterianos pode iniciar o trabalho prematuro. Postnatalmente, os bebês prematuros estão em alto risco de sepse precoce ou de início tardio2. Os bebês prematuros também freqüentemente experimentam períodos de hipóxia, hipotensão e hiperoxia devido ao seu sistema cardiorrespiratório imaturo, tensão elevada de oxigênio na atmosfera em relação aos experimentados no útero e exposições iagênicas. Além disso, em bebês prematuros, as defesas antioxidantes são imaturas3 e os fatores pró-apoptotice são naturalmente upregulated4. Estresse oxidativo e morte celular levam à ativação do sistema imunológico e neuroinflamação. Estes fatores combinados são pensados para contribuir para a vulnerabilidade do desenvolvimento e fisiofiária do cérebro, e resultar ou exacerbar a encefalopatia associada com maus resultados de desenvolvimento em bebês prematuros5,6,7.
Devido às semelhanças físicas e de desenvolvimento que o cérebro furão compartilha com o cérebro humano, o furão é uma espécie atraente para modelar lesão cerebral8,9,10,11,12. Furões também são candidatos ideais para modelar o cérebro humano prematuro, como eles nascem lissencefálicos e desenvolver cérebros gironcfálicos pós-natal, que fornece uma janela para expor o cérebro em desenvolvimento para insultos que imitam aqueles experimentados por bebês nascidos prematuros. Ao nascer, o desenvolvimento do cérebro de furão é semelhante a um feto humano de 13 semanas, com kits pós-parto (P) 17 considerados equivalentes a uma criança de 32 a 36 semanas de gestação13.
Nosso grupo publicou recentemente um modelo de lesão cerebral extremamente prematuro (<28 semanas) no furão P10, combinando sensibilização inflamatória com lipopolissacarídeos de Escherichia coli (LPS) com posterior exposição à hipóxia e hiperoxia12. No protocolo a seguir, descrevemos agora um modelo prematuro tardio no furão P17, onde a sensibilização do LPS é seguida por isquemia cerebral bilateral, hipóxia e hiperoxia. Isso resulta em lesão mais grave em um subconjunto de animais, e mais estreitamente modela a interação complexa de inflamação prolongada, isquemia, hipóxia e estresse oxidativo experimentado em uma série de bebês prematuros que desenvolvem lesão cerebral.
Protocol
Representative Results
Discussion
Devido às semelhanças físicas e de desenvolvimento compartilhadas entre o cérebro furão e o cérebro humano, o furão está sendo cada vez mais usado para modelar lesões cerebrais adultas e de desenvolvimento. 8,9,10,11,12. No entanto, a pesquisa até o momento sugere que o cérebro furão é resistente à lesão inicial, bem como altamente plástico, co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O desenvolvimento do modelo foi financiado pela Fundação Bill e Melinda Gates, bem como pela concessão do NIH 5R21NS093154-02 (NICHD).
Materials
| 80% Oxygen | Praxair | ||
| 9% Oxygen | Praxair | ||
| Absorbent benchtop protector | Kimtech | 7546 | |
| Automated catwalk | Noldus | ||
| Betadine surgical scrub | |||
| Bupivacaine | Patterson Veterinary | 07-888-9382 | |
| Buprenorphine | |||
| Calipers | SRA Measurement Products | ME-CAL-FP-200 | 200mm range, .01 mm resolution |
| Cotton Gauze Sponge | Fisher Scientific | 22028556 | |
| Curved fine hemostat | Roboz | RS-7101 | |
| Curved forceps | World Precision Instruments | 501215 | |
| Curved suture-tying hemostat | Roboz | RS-7111 | |
| Ethovision tracking software | Noldus | ||
| Eye Lubricant | Rugby | NDC 0536-1970-72 | |
| Ferrets (Mustela putorius furo) | Marshall Biosciences | Outbred (no specific strain) | |
| Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% (Phosphate Buffer/Certified) |
| Hair Clippers | Conair | GMT175N | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | 0.3 cc 3 mm 31G |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Lidocaine | Patterson Veterinary | 07-808-8202 | |
| LPS | List Biological | LPS Ultrapure #423 | |
| Oxygen sensor | BW Gas Alert | GAXT-X-DL-2 | |
| Pentobarbital | |||
| Plastic chamber | Tellfresh | 1960 | 10L; 373x270x135mm |
| Saline Solution, 0.9% | Hospira | RL-4492 | |
| Scalpel blade | Integra Miltex | 297 | |
| Scalpel handle | World Precision Instruments | 500236 | #3, 13cm |
| Sterile suture | Fine Science Tools | 18020-50 | Braided Silk, 5/0 |
| Surgical clip applicator | Fine Science Tools | 12020-09 | |
| Surgical clip remover | Fine Science Tools | 12023-00 | |
| Surgical drapes | Medline Unidrape | VET3000 | |
| Surgical gloves | Ansell Perry Inc | 5785004 | |
| Surigical clips | Fine Science Tools | 12022-09 | |
| Thermometer (rectal) | YSI | Precision 4000A | |
| Thermometer (water) | Fisher Scientific | 14-648-26 | |
| Umbilical tape | Grafco | 3031 | Sterile |
| Water bath | Thermo Scientific | TSCOL19 | 19L |
References
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