Summary

Test immunoistochimico per il rilevamento dell'antigene del lyssavirus da tessuti fissati con formalina

Published: October 26, 2021
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo di test immunoistochimico per la rilevazione dell’antigene del virus della rabbia come test diagnostico alternativo per i tessuti fissati alla formalina.

Abstract

Una delle principali modalità diagnostiche per la rabbia è il rilevamento del complesso virale ribonucleoproteina (antigene) (antigene) nei campioni di tessuto infetto. Mentre il test degli anticorpi fluorescenti diretti (DFA) o il test immunoistochimico rapido diretto (DRIT) sono più comunemente utilizzati per il rilevamento dell’antigene, entrambi i test richiedono tessuti freschi e / o congelati per le impronte sui vetrini prima del rilevamento dell’antigene utilizzando anticorpi. Se i campioni vengono raccolti e fissati in formalina, nessuno dei due test è ottimale per il rilevamento dell’antigene, tuttavia, il test può essere eseguito mediante immunoistochimica convenzionale (IHC) dopo l’incorporamento in blocchi di paraffina e sezionamento. Con questo metodo IHC, i tessuti vengono colorati con anticorpi antirabbici, le sezioni vengono deparaffinizzate, l’antigene recuperato mediante proteolisi parziale o altri metodi e incubato con anticorpi primari e secondari. Gli antigeni vengono colorati utilizzando perossidasi di rafano / amminoetilcarazolo e contromacchiati con ematossilina per la visualizzazione utilizzando un microscopio ottico. Oltre al rilevamento specifico dell’antigene, la fissazione della formalina offre altri vantaggi come la determinazione dei cambiamenti istologici, condizioni rilassate per la conservazione e il trasporto dei campioni (a temperatura ambiente), capacità di testare casi retrospettivi e una maggiore sicurezza biologica attraverso l’inattivazione di agenti infettivi.

Introduction

La rabbia è un’encefalite progressiva acuta causata dai virus a RNA a senso negativo appartenenti al genere lyssavirus1. Quasi il 99% di tutti i decessi umani causati dall’infezione da virus della rabbia (RABV), il tipo di membro del genere, è trasmesso dai cani2. La diagnosi di rabbia di animali sospetti si basa sulla rilevazione di antigene (principalmente nucleoproteina codificata virale, proteina N) in complesso con RNA genomico (complesso ribonucleoproteico, RNP) nel tessuto cerebrale3. Il rilevamento dell’antigene mediante il test degli anticorpi fluorescenti diretti (DFA) è considerato il gold standard per la diagnosi dirabbia 4. Il metodo utilizza materiale cerebrale congelato fresco o fresco, un’impronta tattile su un vetrino, fissazione in acetone, colorazione utilizzando anticorpi fluorescenti isotiocianati (FITC) etichettati come monoclonali o policlonali (mAbs / pAbs) e letti dalla microscopia a fluorescenza5. Il test DFA è rapido, sensibile e specifico per il rilevamento dell’antigene della rabbia nel tessuto cerebrale fresco. Recentemente, un test immunoistochimico rapido diretto (DRIT), tecnica di immunoistochimica modificata (IHC), ha dimostrato di mostrare una sensibilità simile al DFA ma offre il vantaggio della microscopia ottica per lavisualizzazione 6. Mentre il metodo di rilevamento utilizzato in DRIT è simile a IHC, la fase iniziale utilizza tessuti freschi o congelati per generare impressioni tattili del campione seguite dalla fissazione in formalina.

L’IHC è una tecnica ampiamente utilizzata per determinare i cambiamenti istologici e il rilevamento di proteine utilizzando anticorpi specifici in tessuti fissati con formalina incorporati in blocchi di paraffina. IHC è un test alternativo consolidato per il rilevamento dell’antigene della rabbia nelle sezioni tissutali7. IHC è stato particolarmente utilizzato per la diagnosi di casi retrospettivi che hanno mostrato malattie neurologiche per determinare il carico dellarabbia 8. I tessuti fissati in formalina incorporati nella paraffina preservano le proteine per il rilevamento anche dopo diversi anni se conservati a temperatura ambiente9. Il trattamento con formalina modifica le proteine attraversando e alterando le catene laterali degli aminoacidi, il che potrebbe rendere gli epitopi non più reattivi contro gli anticorpi10. Mentre il test IHC per il rilevamento dell’antigene della rabbia coinvolge mAbs o pAbs, quest’ultimo è vantaggioso in quanto possono essere rilevati più epitopi e lyssavirus divergenti11.

Le fasi standard coinvolte nell’IHC sono la fissazione della formalina dei tessuti, l’incorporamento in blocchi di paraffina, il sezionamento dei tessuti, la deparaffinizzazione e l’idratazione, il recupero dell’epitopo, la reattività contro gli anticorpi primari e secondari e lo sviluppo utilizzando substrati cromogenici. Questo manoscritto descrive un resoconto dettagliato del protocollo per la diagnosi della rabbia. Per il rilevamento dell’antigene della rabbia, viene utilizzato il siero di topo immunizzato con RABV (pAbs) generato presso i Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie (CDC) di Atlanta, in Georgia, in combinazione con anticorpi secondari anti-topo biotinilati. Gli addominali biotinilati sono rilevati dall’aggiunta del complesso streptaviduina-rafano perossidasi (HRP) seguito dallo sviluppo del colore con substrato amino-etilcarbazolo.

Protocol

Mentre il protocollo IHC è stato eseguito su tessuti fissati alla formalina, che inattiva RABV se presente, devono essere seguiti correttamente protocolli di biosicurezza appropriati. Tutte le procedure di biosicurezza sono descritte nella Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm), incluso l’uso di adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) e l’obbligo di vaccinazione come descritto12. Inoltre…

Representative Results

La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi della colorazione IHC di campioni di controllo positivi e negativi in diversi tessuti cerebrali testati. La Figura 2A,D,G rappresenta campioni positivi a 200x, mentre la Figura 2B,E,H corrisponde rispettivamente all’ingrandimento 400x. Figura 2A-C corrisponde al tronco cereb…

Discussion

A causa dell’elevato tasso di mortalità della rabbia dopo l’insorgenza dei sintomi, la diagnosi di animali sospetti per l’infezione da RABV è estremamente critica per un appropriato trattamento profilattico post-esposizione. La diagnosi di rabbia dipende principalmente da tecniche basate su DFA, DRIT e PCR che utilizzano tessuti freschi o congelati. Per il test di tessuti fissati alla formalina, il test IHC fornisce un metodo alternativo per il rilevamento sensibile e specifico dell’antigene RABV. Mentre i tessuti fiss…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo i laboratori, gli epidemiologi e gli affiliati con i dipartimenti di sanità pubblica per la presentazione di campioni ai Centri per il controllo e la prevenzione delle malattie. I risultati e le conclusioni di questo rapporto sono quelli degli autori e non rappresentano necessariamente la posizione ufficiale dei Centers for Disease Control and Prevention. L’uso di nomi commerciali e fonti commerciali è solo per l’identificazione e non implica l’approvazione da parte dei Centers for Disease Control and Prevention.

Materials

3% hydrogen peroxide Pharamacy brands Off the shelf 3% H2O2
3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC) Millipore Sigma A6926
Acetate Buffer pH 5.2 Poly Scientific R&D Corp. s140
Buffered Formalin 10% Phosphate Buffered Fisher Scientific SF100-4 Certified
Cover slips Corning Fisher Scientific 12-553-471 24 X 50 mm
Ethanol 190 Proof Pharmco-AAPER 111000190
Ethanol 200 Proof Pharmco-AAPER 111000200
Gill's hematoxylin formulation #2 Fisher Scientific CS401-1D
HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kit seracare 71-00-18 Mouse Primary Antibody 
ImmunoHistoMount Millipore Sigma i1161 Mounting media
N,N, Dimethyl formamide GR Fisher Scientific D119
Phosphate Buffered Saline  HyClone RR14440.01 01M, pH 7.2 (pH 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X/0.95 Objective Multiple vendors
Plan-APOCHROMATIC 20X/0.75 Objective Multiple vendors
Pronase Millipore Sigma 53702 Protease, Streptomyces griseus
Scott's Tap Water  Poly Scientific R&D Corp. s1887
Tissue-Tek Slide stain set Fisher Scientific 50-294-72
TWEEN-80  Millipore Sigma P1754
Xylene Fisher Scientific X3S-4 Histological Grade
Zeiss Axioplan 2 imaging – microscope Multiple vendors

References

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Cite This Article
Niezgoda, M., Subbian Satheshkumar, P. Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues. J. Vis. Exp. (176), e60138, doi:10.3791/60138 (2021).

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