Her præsenterer vi en protokol for at kvantificere reden bygnings adfærd i mus, som vides at være svækket i flere neurologiske lidelser og sygdomme. Denne protokol undersøger nytten af fire materialer og giver mulighed for at kvantificere rater aftalen i scoring, forbedre validiteten og pålideligheden af analysen.
Nest Building er en medfødte adfærd i mandlige og kvindelige gnavere, selv når de rejses i laboratorie indstillinger. Som sådan giver mange forskere gnavere syntetiske og/eller naturlige materialer (såsom sejlgarn, væv, bomuld, papir og hø) som en målestok for deres generelle trivsel og som en supplerende vurdering for at forudsige det mulige fald i kognition. Ændringer i indlejrings adfærd, såsom manglende oprettelse af en reden, indikerer typisk en ændring i sundhed eller velfærd. Hertil kommer, at indlejring adfærd er følsom over for mange miljømæssige og fysiologiske udfordringer, samt mange genetiske mutationer underliggende patologiske sygdomstilstande. Følgende protokol beskriver et nesting Behavior paradigme, der udforsker brugen af fire typer af indlejrings materiale. Desuden anvender protokollen intraclass korrelationer til at påvise, at Inter-rater pålidelighed er højere, når reder er konstrueret ud af strimlet papir sammenlignet med andre fælles redematerialer såsom bomulds firkanter, papir drejninger og bløde COB Sengetøj. Den valgte metodologi og statistiske overvejelser (dvs. intraclass korrelation) for denne analyse kan være af interesse for dem, der udfører eksperimenter, der vurderer leve kvaliteten af mus.
Nest Building er en medfødte opførsel i mange dyr som fugle, fisk, gnavere og store aber, og det tiltrækker mere opmærksomhed for dets potentielle nytte i studiet af neurologiske sygdomme og lidelser karakteriseret ved formindsket velvære og nedsat dagligdags aktiviteter1. Mus, både mænd og kvinder, opbygge lignende mellemstore reder til reproduktive formål, varme bevarelse, og husly; endnu vigtigere, de fortsætter med at gøre det, selv når de rejses i laboratorie indstillinger2. Hess, Petrovich, og Goodwin3 hævder, at biologisk-passende stimuli er altafgørende for at fremkalde biologisk-passende adfærd såsom indlejring; men en række naturlige og kunstige materialer, såsom hø, hamp, bomuld sejlgarn, papirstrimler, bomuld dental bolde, og pressede bomulds firkanter, er blevet brugt til at vurdere reden bygning adfærd2. Ændringer i disse indlejrings adfærd (dvs. manglende oprettelse af en rede ud af det medfølgende materiale) indikerer generelt en ændring i sundhed eller velfærd. I de fleste tilfælde, en mangel på reden bygning tilskrives flere faktorer, der negativt påvirker trivsel. Sådanne eksempler, der alle effektivt har reduceret kvaliteten af reden bygning i mus omfatter ekstreme temperaturer; smertefuld stimulation; induceret sygdom og infektion; genetiske mutationer; og hjernelæsioner i de mediale præoptiske områder, septum, og hippocampus4,5,6.
Alzheimers sygdom er en progressiv neurodegenerativ sygdom karakteriseret ved tab af hjernevæv, ophobning af ekstracellulære amyloid-β plaques, og intracellulære neurofibrillære tangles komponeret hyperfosforyleret microtubule-associeret protein, Tau7. Desuden er Alzheimers sygdom karakteriseret ved, især, underskud i læring og hukommelse og nedskrivninger af dagligdags aktiviteter. I mus undersøges dagligdags aktiviteter almindeligvis via cirkadiske hjul, der kører8,9,10,11, selv om nye alternativer, såsom indlejring, vokser i popularitet. Nesting har vist sig at være følsom over for manipulationer (f. eks. genetiske mutationer, miljømæssige stressorer), der er identificeret som risikofaktorer og/eller årsager til Alzheimers sygdom. Som sådan, indlejring kan bruges som en supplerende eller supplerende analyse i mange muse stammer, der modellere disse egenskaber af Alzheimers sygdom. For eksempel har diakon og kolleger12 målt reden bygning af Tg2576 mus med den svenske amyloid forløber protein (APPswe) og presenilin 1 (PS1) genetiske mutationer. Kvaliteten af reder konstrueret af gruppe-husede Tg2576 mus var betydeligt værre end dværg kontrol på både 3-og 12-måneders alderen. Efter aftale med disse resultater rapporterede FILALI et al.13 , at de enkelt husede APPswe/PS1 hanmus givet to stykker af 5 x 5 cm bomuld bygget betydeligt fattigere reder som bedømt på en skala fra 1-5 (1 = nestlet ikke rørt, 5 = en nær perfekt reden). Transgene mus konsekvent bygget dårligere reder på 6-, 9-og 12-måneders alderen i forhold til deres dværg modparter, og i nogle tilfælde, appswe/PS1 mus helt undladt at bygge en reden ud af den medfølgende bomuld.
Tidligere forskning fra vores laboratorium har vist, at dværg C57BL/6j-mus opbygger betydeligt bedre reder ud af bomulds firkanter sammenlignet med CRND8 og CRND8/E4-mus9. Men de fleste eksperimenter med pressede bomulds firkanter ser ud til at være variable, mens dværg-mus ikke viser forventede high scores i forhold til Transgene mus, der forventes at vise meget lave scorer i indlejring2, hvilket delvis kan føre til en manglende forskelle i de anslåede parametre (dvs. gennemsnitlige forskelle) og Statistisk signifikans. Manglen på forskelle kan delvis skyldes utilstrækkelig ældning af mus eller tid afsat til indlejring. Alternativt kan indlejrings materiale være en yderligere udfordring, hvilket resulterer i større variation på grund af forskernes metodologiske præferencer i mængden og typen af materiale, som endda kan interagere med muse stammen. F. eks. leverede Robinson-Junker og kolleger14 forarbejdede eller uforarbejdede strøelse af forskellige størrelser (dvs. små eller store flager) til C3H/hencrl-mus og Balb/canncrl-mus, som almindeligvis observeres henholdsvis som fattige og stærke Nest Builders. Når de leveres uforarbejdede strøelse, C3H mus bygget mindre komplekse, men lignende i kvalitet reder i forhold til dem af BALB/c mus. På samme måde sammenlignede Martin og kolleger15 reden kompleksitet af forskellige indlejrings materialer givet til hjorte mus, en fjern slægtning af mus musculus arter, der har særskilte evolutionære forskelle (dvs. mere tilbøjelige til at burrow i træer og under børsten og er mere aktive i fangenskab), men modtager lignende opdræts pleje som almindelige laboratorie mus og bygge reder ud af alle tilgængelige bløde, fibrøse materiale16,17,18. Hunner og opdrættere med pup i hjemmet bur bygget mere komplekse reder end mænd, og forfatterne tyder på, at disse adfærdsmæssige forskelle kan skyldes tilknyttede ændringer i progesteron koncentrationer i hjorte mus15. Endnu vigtigere er det, at mus byggede mere komplekse reder bestående af brunt papir efterfulgt af bomulds firkanter og bomulds cylindre, og de mindst komplekse reder blev konstrueret ud af hvidt papir og spredte mini-bomulds firkanter.
På trods af den stigende popularitet af indlejring, overvejelser om videnskabeligt gyldige, omkostningseffektive, og tidsfølsomme praksis er minimalt diskuteret. I betragtning af ovennævnte metodologiske og økonomiske udfordringer, undersøger denne protokol nytten af forskellige indlejrings materialer-bomulds firkanter, papir drejninger, strimlet papir og forarbejdet strøelse-i indlejrings adfærd. Specifikt, vi leverede alle redematerialer til både alderen C57BL/6j dværg kontroller og Alzheimers sygdom ApoE E4 mus for at undersøge enhver potentiel genotype af materielle interaktioner i indlejring kvalitet. Derudover søgte eksperimentet at vurdere Inter-rater pålidelighed af reder konstrueret af forskellige materialer. Samlet set viser denne protokol overlegenhed af et redemateriale i denne prøve-makuleret papir-i form af reden kvalitet og scorer aftale, med den hensigt at forbedre validiteten og pålideligheden af nesting assay.
Indlejring er en evolutionært vigtig gnaver adfærd og er blevet brugt til at vurdere aktiviteten af daglig levende og generelle trivsel i mus2. Den lethed at gennemføre testen, dens pålidelighed, og dens ansigt gyldighed gør indlejring et praktisk supplement til mange adfærdsmæssige tests såsom burroning, døgnrytme, og grooming. Men, som indlejring bliver mere almindeligt udnyttet i laboratoriet, de forskellige kombinationer til at gennemføre, kvantificere, og fortolke indlejring stigning. Som sådan er der behov for yderligere forskning for at udforske de bedste metodisk og praktisk forsvarlige procedurer for indlejring, således at validiteten og pålideligheden af analysen ikke ofres for omkostninger, tidspunkt for testning og andre procedurer, der reducerer test byrden .
Nest bygnings kvalitet er faktisk følsom over for den type strøelse, der leveres, samt genotype. Samlet set byggede dværg-mus betydeligt bedre reder sammenlignet med ApoE E4-mus uanset redematerialet; men både dværg og ApoE E4 mus bygge betydeligt højere kvalitet reder ud af strimlet papir i forhold til de tre andre nesting materialer. Andre undersøgelser giver underbyggende beviser vedrørende det strikkede papir: mus konstrueret mere komplekse reder ud af strikkede papirstrimler end med presset bomuld firkanter, væv, og Aspen sengetøj33. Desuden er reder konstrueret ud af strikkede papirstrimler blevet kvalitativt evalueret som mere “naturalistiske” end dem, der er lavet af andre materialer, som er karakteriseret ved formen af reden selv og højden af væggene omkring reden hulrum i for at danne en kuppel6,33. Som sådan, udvælgelse af korrekt materiale til denne analyse er afgørende for bedre at observere naturlige adfærd i et relativt kontrolleret miljø, dvs, at laboratoriet indstilling. Endnu vigtigere, selv om denne protokol vurderet indlejring én gang på 9 – 12 måneder, vi understreger, at nesting skal udføres i flere aldre. Enkelheden i denne protokol gør det muligt at gennemføres flere gange, ideelt før fremkomsten af underskud, der ledsager neurodegeneration. Gentagne målinger giver mulighed for at dokumentere den sandsynlige årsagssammenhæng med neurodegeneration i nedsat indlejrings evne.
Naturlige reden bygning har vist sig at afvige blandt mus af forskellige baggrunds stammer34, og som sådan, den samlede kvalitet og form af reden kan afvige ikke på grund af transgenet af interesse, men på grund af baggrundsstammen. For eksempel blev forfædrene til C57BL/6 mus betragtet som “Hole”-nestere, hvorimod forfædrene til BALB/C-mus blev betragtet som “Surface”-nestere35. Mus på C3H baggrund eller krydser med denne stamme, såsom hybrid C3H/he-C57BL/6 med E4 anvendes i Graybeal et al.9 anses også for at være fattige nestere; således bør forskerne kraftigt overveje at bruge Control mus på samme baggrund som Transgene mus, som generelt ville forbedre den direkte, kausative rolle af transgenet (s), snarere end baggrunden, i neurodegeneration og efterfølgende underskud i reden bygnings adfærd.
Nogle eksperimenter udnytter ofte en enkelt målscorer til kvalitativt at bedømme kompleksiteten af reden; men vi gør argumentet til at omfatte flere scorere, og endnu vigtigere, scorers blinde til eksperimentelle betingelser. Gennem denne tilgang udnyttede vi tre uafhængige, blinde scorere og en intraclass korrelation til at vurdere aftalen blandt de scorere, der med grunduddannelse gav høje intraclass korrelationer, som var tegn på høj Inter-rater pålidelighed og stærk aftale om Nest kvalitet. Desuden havde snesevis af reder bestående af strikkede papir og bomulds firkanter den højeste intraclass korrelationer, en indikation af stærkere aftale og større konsistens blandt de scorere. Den stærke aftale giver også berettigelse til gennemsnitlige de mange scores sammen, en strategi tilfældigt implementeret i adfærdsmæssige forskning. Selv om denne strategi kræver flere individer og formentlig mere tid til at score reder, det effektivt reducerer bias i kvalitative vurderinger såsom indlejring.
De nesting materialer, der anvendes i denne analyse, var omtrent lige i prisen, bortset fra det bløde COB-sengetøj. Kommerciel strøelse til indlejring kan være økonomisk ressourcestærke for nogle eksperimentanter; Men, Martin et al.15 Bemærk, at bomulds firkanter, sammenlignet med andre materialer såsom mønster papir, er et af de dyreste materialer til rådighed for køb. Dette kan skyldes let tilgængelighed, opbevaring og administration, men andre forskere kan vælge tilsvarende gyldige og pålidelige materialer, især når de udfordres af et stort antal dyr i et anlæg, antallet af indlejrings forsøg, tidsbegrænsninger for scorer reder, og høje bur omkostninger. Således, strimlet papir kan være en mere gennemførlig og passende løsning. Derudover kan dataopsamling for vores metode udføres med det samme (dvs. scoring personligt), selv om fotografier bør overvejes højt for at registrere, gemme og omkvantificere reder, hvis det ønskes med henblik på at vurdere Inter-og intra-rater pålidelighed på et senere tidspunkt. Som bemærket, vi kraftigt understrege inddragelsen af flere scorere for “test, re-test” praksis til at vurdere for aftale, da disse metodisk forsvarlige procedurer ofte overset.
Afslutningsvis mener vi, at metodologien og de statistiske overvejelser (dvs., intraclass korrelation) for denne analyse kan være af interesse for eksperimenter, der vurderer kvaliteten af levende, generelle trivsel, og aktiviteter i daglig lever i mus.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Kevin Quant, Mario Martinez og Edwin Portillo for at have scoret Nests, Rachel Barkey for at assistere i forberedelsen til optagelserne, og Stephen Lippi og Deborah Neely for korrekturlæsning af dette manuskript. Vi vil også gerne takke Institut for psykologi for at dække omkostningerne ved bure til dette eksperiment, og krasnow Institute Animal Facility pedeller for deres støtte.
Corncob bedding | Envigo | 7092 | 1/8 in bedding for cotton squares, shredded paper, and paper twist trials |
Cotton Squares | Envigo | Iso-Blox | |
Diamond Twists | Envigo | 7979C.CS | Paper twists used in protocol |
Mouse – APOE4 e4 | Jackson Laboratories | #012307 | Homozygous APEO4 e4 mouse bred with hemizyous J20 mouse |
Mouse – C57BL/6J | Jackson Laboratories | #000664 | Wildtype mouse for controls |
Mouse – J20 | Jackson Laboratories | #006293 | Hemizygous mouse bred with the homozygous APOE e4 mouse to generate cross |
Rstudio | R Core Team | V1.1.463 | Run with R version 3.5.3 (2019-03-11) — "Great Truth". Note: additional R Packages are included in provided code and can be installed from CRAN |
Soft Cob | Envigo | 7087C |