Högeffektiv transfektion av primära makrofager med in vitro-transkriberad mRNA
Summary
Makrofager, särskilt primära makrofager, är utmanande att transfect som de är specialiserade på att upptäcka molekyler av icke-själv ursprung. Vi beskriver ett protokoll som tillåter mycket effektiv transfektion av primära makrofager med mRNA genereras från DNA-mallar såsom plasmider.
Abstract
Makrofager är fagocyterande celler specialiserade på att upptäcka molekyler av icke-själv ursprung. För detta ändamål är de utrustade med ett stort utbud av mönster igenkännings receptorer (PRRs). Tyvärr gör detta också makrofager särskilt utmanande att transfect som transfektion reagens och transfekterade nukleinsyror ofta erkänns av PRRS som icke-jaget. Därför, transfektion resulterar ofta i makrofagaktivering och nedbrytning av transfekterade nukleinsyror eller ens i självmord av makrofager. Här beskriver vi ett protokoll som tillåter mycket effektiv transfektion av murin primära makrofager såsom peritonealdialys makrofager (PM) och benmärg-derived makrofager (BMDM) med mRNA in vitro transkriberas från DNA-mallar såsom plasmider. Med detta enkla protokoll, transfektionshastigheter på cirka 50-65% för PM och om 85% för BMDM uppnås utan cytotoxicitet eller immunogenicitet observerats. Vi beskriver i detalj generering av mRNA för transfektion från DNA konstruktioner såsom plasmider och transfektion förfarande.
Introduction
Makrofager är fagocyterande celler som specialiserat sig på att upptäcka, intag och förnedrande mikrober, apoptotiska celler och cellulära skräp. Dessutom, de hjälper till att iscengöra immunsvar genom att utsönta cytokiner och chemokiner och genom att presentera antigener till T-celler och B-celler. Macrophages spelar också viktiga roller i många andra processer, såsom sårläkning, åderförkalkning, tumorigenes och fetma.
För att kunna detektera icke-själv-molekyler som patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) och out-of-Place molekyler såsom skadeassocierade molekylära mönster (DAMPs), makrofager är utrustade med ett stort utbud av mönsterigenkänning receptorer (PRR)1. Tyvärr gör detta också makrofager särskilt utmanande att transfect2 som transfektion reagens3 och transfekterade nukleinsyror4,5,6,7 ofta erkänns av PRRS som icke-jaget. Av denna anledning, transfektion av makrofager med kemiska eller fysikaliska metoder8 vanligtvis resulterar i makrofagaktivering och nedbrytning av transfekterade nukleinsyror eller ens i makrofagsjälvmord via pyroptos, en form av programmerad lytisk celldöd utlöst efter erkännande av cytosoliska PAMPs/damps såsom DNA eller främmande RNA9. Biologisk transfektion av makrofager med virus som adenovirus eller lentivirus som vektorer är ofta mer effektiv, men byggandet av sådana virusvektorer är tidskrävande och kräver biosäkerhet nivå 2 utrustning10,11.
Även om makrofager är föremål för intensiv forskning hämmas därför analys av deras funktioner på molekylär nivå eftersom ett av de viktigaste verktygen för molekylärbiologi, transfektion av nukleinsyra konstruktioner för EXOGEN uttryck av proteiner, är knappast tillämplig. Detta tvingar ofta forskare att använda makrofagliknande cellinjer i stället för bona fide makrofager. Tillämpningar för nukleinsyra konstruera transfektion inkludera uttryck av muterade eller märkta protein versioner, överuttryck av ett specifikt protein, protein nytt uttryck i en respektive knockout bakgrund och uttryck av proteiner från andra arter (t. ex. , CRE driver eller guide RNA och Cas9 för riktad genknockout).
Här, vi beskriver ett protokoll som tillåter mycket effektiv transfektion av (vanligtvis svårt att transfect) primära makrofager, som är murina peritonealdialys makrofager (PM) och benmärg-derived makrofager (BMDM) med mRNA genereras från DNA-mallar såsom plasmider. Viktigt, den in vitro-transkriberas mRNA genereras med hjälp av detta protokoll innehåller naturligt förekommande modifierade nukleosider 5-metyl-CTP och pseudo-UTP som minskar immunogenicitet och förbättra stabiliteten4,6,7,12,13. Dessutom är 5 ‘-ändarna av in vitro transkriberas mRNA defosforyleras av antarktisk fosfatas för att förhindra erkännande av Rig-i Complex14,15. Detta minimerar medfödda immun erkännande av in vitro transkriberas mRNA. Med vår lätt att utföra protokoll, transfektion priser mellan 50-65% (peritoneal makrofager (PM)) och 85% (BMDM) uppnås medan, viktigare, det finns ingen cytotoxicitet eller immunogenicitet observerats. Vi beskriver i detalj (i) hur immunologiskt tystade mRNA för transfektion kan genereras från DNA-konstruktioner som plasmider och (II) själva transfektioningreppet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi ett protokoll för mycket effektiv transfektion av vanligtvis svåra att transfect primära makrofager med in vitro transkriberas mRNA. Viktigt är att transfektion av makrofager som använder detta protokoll inte inducerar celldöd eller aktiverar proinflammatorisk signalering som indikerar att varken transfektion reagens eller transfekterade mRNA erkänns som icke-Self.
Kvaliteten på mRNA är av avgörande betydelse för framgångsrik transfektion av makrofager med hjäl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).
Materials
| 5-methyl-CTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1138S | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase | New England BioLabs | M0289 | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase reaction buffer (10X) | New England BioLabs | B0289 | stored at -20 °C |
| anti-NEMO/IKKγ antibody | Invitrogen | MA1-41046 | stored at -20 °C |
| anti-β-actin antibody | Sigma-Aldrich | A2228 | stored at -20 °C |
| Petri dishes 92,16 mm with cams | Sarstedt | 821,473 | stored at RT |
| CD11b Microbeads mouse and human | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | stored at 4 °C |
| Cre recombinase + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C |
|
| Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C |
|
| DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | stored at RT |
| eGFP + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C |
|
| eGFP + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C |
|
| Fast Digest buffer (10X) | Thermo Scientific | B64 | stored at -20 °C |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | stored at -20 °C |
| high-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase | New England Biolabs Inc | M0491S | stored at -20 °C |
| IKKβ + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C |
|
| IKKβ + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C | |
| in vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) | New England BioLabs | E2060 | stored at -20 °C |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | stored at RT |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | stored at RT |
| mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER | Polyplus transfection | 409-0001DE | stored at 4 °C |
| Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid | Addgene | 11105 | stored at -20 °C |
| Mutant NEMOC54/347A plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
| pEGFP-N3 plasmid | Addgene | 62043 | stored at -20 °C |
| poly(I:C) | Calbiochem | 528906 | stored at -20 °C |
| pPGK-Cre plasmid | F. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C | ||
| pseudo-UTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1139S | stored at -20 °C |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | stored at RT |
| Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated | BioLegend | 101212 | stored at 4 °C |
| Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated | eBioscience | 12-4801-82 | stored at 4 °C |
| recombinant M-CSF | Peprotech | 315-02 | stored at -20 °C |
| RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit | ThermoFisher Scientific | AM1908 | stored at 4 °C |
| RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | stored at RT |
| ultrapure LPS from E.coli O111:B4 | Invivogen | stored at -20 °C | |
| Wild type IKKβ plasmid | Addgene | 11103 | stored at -20 °C |
| Wild type NEMO plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
References
- Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
- Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
- Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
- Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
- Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
- Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
- Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
- Hornung, V., et al. 5′-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
- Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5′-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
- Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
- Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
- Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
- Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, 29-43 (2018).
