Aislamiento de poblaciones de neuronas específicas de Roundworm Caenorhabditis elegans
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento simple de grupos específicos de células neuronales vivas que expresan proteína fluorescente verde de líneas transgénicas de Caenorhabditis elegans. Este método permite una variedad de estudios ex vivo centrados en neuronas específicas y tiene la capacidad de aislar las células para el cultivo a corto plazo.
Abstract
Durante el proceso de envejecimiento, muchas células acumulan altos niveles de daño que conducen a la disfunción celular, que subyace en muchas condiciones geriátricas y patológicas. Las neuronas postmitoticas representan un tipo de célula principal afectada por el envejecimiento. Aunque existen múltiples modelos de mamíferos de envejecimiento neuronal, son desafiantes y costosos de establecer. El gusano redondo Caenorhabditis elegans es un modelo potente para estudiar el envejecimiento neuronal, ya que estos animales tienen una vida útil corta, una caja de herramientas genética robusta disponible y un sistema nervioso bien catalogado. El método presentado aquí permite el aislamiento sin fisuras de células específicas basado en la expresión de una proteína fluorescente verde transgénica (GFP). Las líneas animales transgénicas que expresan GFP bajo promotores distintos específicos del tipo de célula se digieren para eliminar la cutícula externa y se interrumpen mecánicamente para producir lodos que contienen varios tipos de células. Las células de interés se separan de las células no objetivo mediante la clasificación celular activada por fluorescencia, o por cuentas magnéticas acopladas anti-GFP. Las células aisladas pueden ser cultivadas por un tiempo limitado o inmediatamente utilizadas para análisis ex vivo específicos de células, como el análisis transcripcional por PCR cuantitativo en tiempo real. Por lo tanto, este protocolo permite un análisis rápido y robusto de las respuestas específicas de las células dentro de diferentes poblaciones neuronales en C. elegans.
Introduction
Durante las últimas décadas, el organismo modelo metazoano Caenorhabditis elegans ha sido un tremendo activo en el estudio de las neuronas, los circuitos neuronales y su papel en las respuestas fisiológicas y conductuales, y el envejecimiento asociado Enfermedades. Una característica única de C. elegans es que los animales son transparentes, lo que permite mapear el linaje de todas las células somáticas adultas1. C. elegans también alberga una cantidad manejable de neuronas, lo que lleva a la morfología y conectividad del sistema nervioso siendo bien entendido2. El linaje celular invariable, la corta vida útil y la abundancia de herramientas genéticas de alto rendimiento disponibles para C. elegans lo convierten en un organismo modelo ideal para el estudio del envejecimiento dentro de diferentes poblaciones neuronales.
El envejecimiento de las neuronas y los trastornos neurodegenerativos son complejos, y cada trastorno tiene firmas patológicas únicas asociadas con él. Sin embargo, para muchos de estos trastornos, como el Parkinson y la enfermedad de Alzheimer, una característica común es la carga progresiva de proteínas mal plegadas3,4,5. En ambas enfermedades, las proteínas se multiplican en sí y se agregan dentro de la célula para causar toxicidad, lo que en última instancia conduce a la muerte celular4,5. Para el envejecimiento adecuado de las neuronas, la homeostasis de las mitocondrias, más específicamente la proteica homeostasis, es importante, ya que las perturbaciones y la dishomeostasis pueden conducir a la neurodegeneración6,7,8. Las células están equipadas con varios mecanismos para mantener la homeostasis proteica, una de las que se trata de la respuesta proteica desplegada (UPR), una vía clásica donde las señales del retículo endoplasmático (ER) activan cascadas de señal intracelular, lo que conduce a una transcripción respuesta9. Al igual que este EPUER, los metazoos muestran una respuesta similar a la pérdida de homeostasis de proteína mitocondrial, el llamado EPU mitocondrial (UPRmt)7,8. C. elegans parece ser el organismo más basal para tener una víamt UPR confirmada y bien definida7.
La función/disfunción de poblaciones neuronales específicas dentro de una red más grande puede ser difícil de evaluar debido a su conectividad intrínseca y complejidad3. Sin embargo, a menudo es necesario estudiar poblaciones neuronales distintas debido a enfermedades específicas del tipo celular con patologías complejas, como las asociadas con la homeostasis de proteínas celulares deterioradas. En C. elegans, poblaciones neuronales específicas pueden ser manipuladas genéticamente permitiendo la observación fácil in vivo. El sistema nervioso de C. elegans consiste principalmente en neuronas, con un pequeño porcentaje de células gliales. En los gusanos hermafroditas adultos, hay aproximadamente 302 neuronas, subdivididas en más de 100 clases diferentes2,10. Las neuronas como las neuronas colinérgicas predominan en las uniones neuromusculares, mientras que las neuronas dopaminérgicas están implicadas principalmente en la sensación10,11. Como tanto la actividad motora como las capacidades sensoriales disminuyen con la edad, es importante detallar los conocimientos mecanicistas sobre los defectos en estas neuronas individuales11,12. Como tal, es necesario un método simple y robusto para aislar las células intactas de interés para estudios ex vivo posteriores.
Aquí, describimos un método eficaz optimizado para el aislamiento rápido de células neuronales específicas que expresan proteína fluorescente verde (GFP) de C. elegans. Este método de aislamiento se puede realizar en gusanos larvarios, juveniles o adultos. El aislamiento de las células de los gusanos larvarias fue publicado previamente por Zhang et al.13 y no se discutirá aquí. Una nota importante aquí es que todos los gusanos deben estar en la misma etapa de la vida para evitar la digestión excesiva del animal o la contaminación de los animales en diferentes etapas de la vida. A través de la interrupción enzimática y mecánica de la cutícula de nematodos, un exoesqueleto alto en colágeno y otras proteínas estructurales, una amplia variedad de células se puede aislar13,14. Las células se pueden aislar a través de citometría de flujo o anticuerpos etiquetados como cuentas magnéticas. Típicamente, el ARN se aísla a través de un método de isotiocianato de fenol y guanidina para asegurar el enriquecimiento de la población celular deseada15. Con mucho cuidado, estas células aisladas se pueden mantener en un matraz de cultivo o en un plato multipozo. Este método representa una herramienta única y poderosa en el estudio de neuronas específicas y tiene la capacidad de aislar células vivas y funcionales para un cultivo posterior.
Protocol
Representative Results
Discussion
El gusano redondo C. elegans es un modelo bien establecidoy potente para estudiar la salud neuronal y la enfermedad 2. Con amplias herramientas genéticas para manipular estos animales y una cantidad manejable de varios tipos de neuronas mapeadas con precisión, una gran cantidad de datos se pueden recopilar con una cantidad relativamente pequeña de material. Aquí, delineamos un método optimizado para aislar neuronas distintas de animales enteros. Al interrumpir las proteínas externas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Dra. Jennifer Fox y a los miembros del laboratorio Khalimonchuk por sus comentarios perspicaces. Reconocemos el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (R01 GM108975 a O.K. y T32 GM107001-01A1 a E.M.G.).
Materials
| 6-well plate | Fisher Scientific | 12-556-004 | |
| Agar, Molecular Biology Grade | VWR | A0930 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Chloroform | Sigma | 496189 | |
| Contess Automated Cell Counter | Invitrogen | Z359629 | |
| DTT | USBiological | D8070 | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| FBS | Omega Scientific | FB-02 | |
| Fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Isopropanol | VWR | BDH1133 | |
| KCl | Amresco | O395 | |
| KH2PO4 | USBiological | P5110 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professionals | 7552 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| MgSO4 | USBiological | M2090 | |
| Na2HPO4·7H2O | USBiological | S5199 | |
| NaCl | VWR | X190 | |
| NaOCl (Bleach) | Clorox | ||
| NaOH | Amresco | O583 | |
| Penicillin-Streptomicen | Fisher Scientific | 15140122 | |
| Peptone Y | USBiological | P3306 | |
| Pronase E | Sigma | 7433 | protease mixture from Streptomyces griseus |
| SDS | Amresco | O227 | |
| SMT1-FLQC fluorescence stereomicroscope | Tritech Research | ||
| Sucrose | USBiological | S8010 | |
| SuperScript IV One-Step synthesis kit | ThermoFisher | 12594025 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | phenol and guanidine isothiocyanate solution |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | T10Z82 | |
| α-GFP magnetic beads | MBL | D153-11 |
References
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