70% 부분 간 절제술과 아세트아미노펜을 결합하여 급성 간 기능 부전의 쥐 모델 생성
Summary
현재 연구에서 개발된 급성 간 부전 동물 모델은 잠재적인 치료법의 연구를 위한 실행 가능한 대안을 제시합니다. 현재 모델은 물리적 및 약물 유발 간 손상의 결합 된 효과를 채택하고 새로운 치료의 잠재력을 연구하기에 적합한 시간 창을 제공합니다.
Abstract
급성 간 부전 (ALF) 신진 대사의 손실의 결과로 다양 한 병 인에 의해 발생 하는 임상 상태, 생 화 확 적인, 합성, 그리고 간 기능 해독. 대부분의 돌이킬 수없는 간 손상 의 경우, 직교 간 이식 (OLT) 유일한 가능한 치료 남아. ALF에 대 한 치료의 치료 잠재력을 연구 하기 위해, ALF의 동물 모델에서 그것의 이전 테스트필수적이다. 현재 연구에서, 쥐에 있는 ALF 모형은 48 시간의 치료 창을 제공하는 70% 부분 간절제술 (PHx) 및 아세트아미노펜 (APAP)의 주사를 결합해서 개발되었습니다. 간 질량의 70%를 절제하기 위해 간 중도 및 좌측 엽을 제거하고 APAP는 2일 동안 수술 후 24시간 주어졌다. ALF 유도 동물에서의 생존은 심각하게 감소되는 것으로 나타났다. ALF의 발달은 알란닌 아미노 트랜스퍼라제(ALT), 아스파르타테 아미노 트랜스퍼라제(AST), 알칼리성 인산파타제(ALP)의 혈청 수준을 변경하여 확인하였다; 프로트롬빈 시간의 변화 (PT); 국제 정상화 비율(INR)의 평가. qPCR에 의한 유전자 발현 프로필에 대한 연구는 세포사멸, 염증 및 간 손상의 진행에 관여하는 유전자의 발현 수준 증가가 나타났다. 간세포의 확산변성 및 면역세포의 침투는 조직학적 평가에 의해 관찰되었다. ALF의 가역성은 합성 건강한 랫트 간세포의 인트라스장내 이식 후 ALT, AST 및 ALP의 생존 및 혈청 수준의 복원에 의해 확인되었다. 이 모델은 ALF의 병리생리학을 연구하고 ALF에 대한 새로운 치료법의 잠재력을 평가하기 위해 이용 가능한 ALF 동물 모델에 대한 신뢰할 수 있는 대안을 제시한다. 두 개의 다른 접근의 사용은 또한 가능한 물리적 및 약물 유발 간 손상의 결합 된 효과 공부. 현재 절차의 재현성과 타당성은 모델의 추가적인 이점입니다.
Introduction
급성 간부전(ALF)은 미국 간질환 연구에 의해 사전 손상 징후 없이 급성 간 손상의 급속한 발달로 정의되며 간장의 합성, 대사 및 해독 기능의 심각한 손상을 특징으로 한다1. ALF는 장기간 에 걸쳐 발생하는 간 손상의 결과로 실패가 발생하는 만성 간 부전과 급성 만성 간 부전 (ACLF)에서 발생하는 만성 간 기능 부전과 는 다르며, 만성 간 질환의 결과로 갑작스러운 간 손상이 발생하는2,3,4. ALF를 위한 유효한 치료는 정형외 간 이식 (OLT) 또는 죽음이 생길 수 있습니다. 간 기증자의 부족으로 인해 ALF를 앓고있는 환자의 사망률이 매우 높습니다.
대체 치료 접근법의 잠재력을 연구하고 ALF의 병리생리학을 더 잘 이해하기 위해서는 인간에서 발생하는 ALF를 반영할 수 있는 동물 모델이 필요합니다. 이미 사용 가능한 ALF 동물 모델의 대부분은 몇 가지 단점이 있습니다. 아세트아미노펜(APAP) 효과는 재현하기 어렵지만 시간적, 임상적, 생화학적 및 병리학적 매개 변수측면에서 가장 유사한 점이 있습니다. APAP-유도 동물 모델은 APAP 및 그중간체에의한 헤모글로빈의 산화에 의한 메테모글로빈혈증의 존재로 인해 종종 문제가 발생한다5,6,7. 또 다른 문제는 예측할 수 없는 복용량 응답 및 죽음의 시간에 의해 반영 된 재현성의 부족. 탄소 테트라 염화물 (CCl4)을사용하여 생산 된 ALF 동물 모델은8, 9,10,11의재현성이좋지 않습니다. 콘카발린 A(Con A) 및 리포슬리당(LPS)-유도 ALF 동물 모델은 자가면역 간 질환에 관여하는 세포 메커니즘의 연구및 패혈증의 연구에서 각각12,13,14,15의이점을 가지고 있지만, 인간 질환의 임상 적 패턴을 반영하지 않는다. 유사하게, 티오아세타미드(TAA)는 또한 활성 대사산물 티오아세타미드 설폭사이드에 대한 생체변환을 필요로 하며 종 변이를16,17,18,19를나타낸다. D-갈락토사민(D-Gal)은 ALF와 유사한 일부 생화학적, 대사적, 생리적 변화를 생성하지만 전체 ALF 병리학적 상태를 반영할 수없다(20,21,22,23) 더 나은 방식으로 ALF 증후군을 반영할 수 있는 ALF 모델을 개발하기 위해 이들 방법 중 2개 이상을 결합하려는 시도는 거의 없었다13. 따라서 질병 매개 변수를 반영할 수 있고, 재현성이 우수하며, 치료 적 개입의 효과를 연구할 충분한 시간을 제공하는 모델을 개발하기 위한 추가 연구가 요구된다.
현재 연구에서, 쥐에 있는 대안 ALF 모형은 부분 간절제술의 효력을 결합하여 만들어졌습니다 (PHx) 간 독성 시약의 더 낮은 복용량. APAP는 간 손상을 일으키는 데있어 잘 확립된 역할을 합니다5,24,25. 그것은 널리 사용 되는 진통제 이며 독성 대사 산물을 형성 하 여 supratherapeutic 복용량에서 간 독성. APAP는 선진국에서 많은 죽음의 원인입니다. 부분 간 절제술로 인한 신체적 상해는 간 재생뿐만 아니라 염증에 관련된 다양한 과정의 활성화를 시작합니다. 간 독성 제제 APAP의 주입은 간세포의 증식을 방지, 간장에서 적대적인 환경을 야기한다. 이것은 동물의 스트레스 기간을 감소시켜, 더 적은 용량의 간독소와 결합하면 절차의 재현성이 향상됩니다. 따라서이 모델을 사용하여 두 가지 유형의 간 손상의 조합 효과가 연구되었습니다. 개발된 ALF 동물 모델을 특성화하기 위해 생리학적 및 생화학적 파라미터가 연구되었다. ALF의 성공적인 가역성은 합성 건강한 랫트 간세포의 이식에 의해 확인되었다.
Protocol
아래에 설명된 절차는 뉴델리 국립 면역학 연구소의 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인되었습니다. 승인의 일련 참조 번호는 IAEC#355/14입니다. 1. 준비 Das B 외26에의해 설명된 바와 같이 외과 적 수술을 준비하십시오. 체중이 200-250g인 6-8주 된 근친 위스타 쥐를 사용하십시오. 표준 동물 관리 조건하에 동물을 수용하고 시술 전후에 쥐 차…
Representative Results
ALF의 동물 모델에서 생존 율70% PHx와 함께 ALF를 유발하는 APAP의 최적 용량은 750 mg/kg 체중으로 표준화되었다. 치료 요법 시작 24 시간 후 70% PHx, 때 동물 완전히 수술에서 회복 했다, 그리고 24 시간 간격에 두 개의 APAP 복용량으로 구성. 사망률은 APAP의 두 번째 투여 후 80%의 비율로 관찰되었고, 48시간 수술 후. 생존율을 카플란-마이어 방법을 통해 분석하고 플롯하였다(도<strong class="xfig…
Discussion
ALF에 적합한 동물 모델의 개발은 ALF의 병인과 진행을 더 잘 이해하기 위해 가장 중요합니다. 잘 특성화 된 ALF 동물 모델은 또한 ALF에 대한 새로운 치료 접근법의 개발 및 시험을위한 기회를 제공합니다. ALF6,12,21, 23,46,47,48의임상적?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 생명 공학의 부서에서 받은 핵심 보조금에 의해 지원 되었다, 면역학의 국립 연구소에 인도정부, 뉴델리.
Materials
| Acetaminophen (Biocetamol) | EG Pharmaceuticals | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Betadine (Povidon-Iodine Solution) | Win-Medicare; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Biological safety cabinet (Class I) | Kartos international; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Cefotaxime (Taxim®) | AlKem; India | cefotaxime sodium injection, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Cell Strainer | Sigma; US | CLS431752 | |
| Collagenase Type I | Gibco by Life Technologies | 17100-017 | |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Drape Sheet | JSD Surgicals, Delhi, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| DPX Mountant | Sigma; US | 6522 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma; US | HT110132 | |
| Forceps | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Glucose | Himedia, India | GRM077 | |
| Hair removing cream (Veet®) | Reckitt Benckiser, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma; US | MHS16 | |
| Heparin sodium salt | Himedia; India | RM554 | |
| Hyaluronidase From Sheep Testes | Sigma; US | H6254 | |
| I.V. Cannula (Plusflon) | Mediplus, India | Ref 1732411420 | |
| Insulin Syringes | BD; US | REF 303060 | |
| Isoflurane (Forane®) | Asecia Queenborough | No B506 | Inhalation Anaesthetic |
| Ketamine (Ketamax®) | Troikaa Pharmaceuticals Ltd. | Ketamine hydrochloride IP, No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Meloxicam (Melonex®) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Micro needle holders straight & curved |
Mercian; England | BS-13-8 | |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Nylon Thread | Mighty; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Percoll® | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Refresh Tears/Eyemist Gel | Allergan India Private Limited/Sun Pharma, India | P3060 | No specific Catalog Number |
| RPMI | Himedia; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scalpel | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Scissors | Major Surgicals; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation; US | No specific Catalog Number | |
| Sucrose | Sigma; US | S0389 | |
| Surgical Blade No. 22 | La Medcare, India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical Board | Locally made | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Surgical White Tape | 3M India; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Sutures | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| Syringes (1ml, 26 G) | Dispo Van; India | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| Trimmer (Clipper) | Philips | NL9206AD-4 DRACHTEN QT9005 | |
| Weighing Machine | Braun | No specific Catalog Number (Local Procurement) | |
| William's E Media | Himedia; India | AT125 | |
| Xylazine (Xylaxin®) | Indian Immunologicals Limited | Sedative, Pre-Anaesthetic, Analgesic and muscle relaxant |
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Cite This Article
Sahay, P., Jain, K., Sinha, P., Das, B., Mishra, A., Kesarwani, A., Sahu, P., Mohan, K. V., Kumar, M. M., Nagarajan, P., Upadhyay, P. Generation of a Rat Model of Acute Liver Failure by Combining 70% Partial Hepatectomy and Acetaminophen. J. Vis. Exp. (153), e60146, doi:10.3791/60146 (2019).