마우스 유방 상피 HC11 및 EpH4 세포의 분화
Summary
우리는 2개의 유방 상피 선, HC11 및 EpH4의 분화 유도를 위한 기술을 기술합니다. 둘 다 우유 단백질을 생성하기 위하여 태아 송아지 송아지 혈청, 인슐린 및 prolactin를 요구하는 동안, EpH4 세포는 3 차원 문화에서 유방구로 완전히 분화할 수 있습니다. 이러한 상보적인 모델은 분화 및 신생물의 신호 환전 연구에 유용하다.
Abstract
Cadherins는 신생물뿐만 아니라 세포 분화의 조절에 중요한 역할을합니다. 여기에서 우리는 2개의 마우스 유방 상피 세포주, HC11 및 EpH4의 분화의 유도의 기원 그리고 방법 및 유방 선 발달 및 신생물 변환의 상호 보완적인 단계를 공부하기 위하여 그들의 사용을 기술합니다.
HC11 마우스 유방 상피 세포주는 임신 한 Balb / c 마우스의 유선에서 유래. 태아 송아지 혈청 및 H이드로코르티손, I은린및 P롤락틴(HIP 배지)을 함유하는 배지에서 플라스틱 페트리 접시 표면에 부착된 합류로 성장하면 차별화된다. 이러한 조건하에서 HC11 세포는 모유 단백질 β-카제인과 유청 산성 단백질(WAP)을 생산하며, 수유 유방 상피 세포와 유사하며, “돔”이라고 불리는 초보적인 유선 구조를 형성합니다.
EpH4 세포주는 임신한 Balb/c 마우스로부터 분리된 자발적으로 불멸의 마우스 유방 선 상피 세포로부터 유래되었다. HC11과 달리 EpH4 세포는 HIP 배지에서 3차원(3D) 성장 조건하에서 배양할 때 스페로이드(맘모스피어라고도 함)로 완전히 분화할 수 있습니다. 세포는 트립시네화되고, 엥겔브레스-홀름-스웜(EHS) 마우스 육종 세포에 의해 생성된 세포외 매트릭스 단백질의 혼합물로 구성된 20% 매트릭스에서 부유하고, 플라스틱 페트리 접시 또는 멀티웰 플레이트를 코팅하는 농축 매트릭스 층 위에 도금되고, 10% 매트릭스 함유 HIP 배지의 층으로 덮여 있다. 이러한 조건하에서 EpH4 세포는 정점 기저 극성, 중공 루멘을 나타내는 중공 스페로이드를 형성하고 β-카제인 및 WAP를 생성합니다.
이러한 기술을 사용하여, 우리의 결과는 카데린 / Rac 신호의 강도가 HC11 세포의 분화에 중요하다는 것을 입증했다. Rac1은 분화에 필요하고 활성 RacV12의 낮은 수준은 분화를 증가시키는 반면, 높은 RacV12 레벨은 신생물을 유도하면서 분화를 차단한다. 대조적으로, EpH4 세포는 RacV12의낮은 수준에 의해 억제되는 유방 상피 분화에 있는 초기 단계를 나타냅니다.
Introduction
일반적인 조직 또는 종양에서, 세포는 3차원 조직에서 그들의 이웃에 접착을 위한 광대한 기회를 가지고 있고, 이것은 고밀도 세포 성장에 의해 배양에서 모방됩니다. 세포 대 세포 접착은 주로 세포 및 조직 구조를 정의하는 카데린 수용체를 통해 매개됩니다. 흥미롭게도, 최근에 는 카데린이 특히 생존 신호1에서신호 변환에 강력한 역할을한다는 것을 입증되었습니다. 역설적으로, 카데린으로부터 방출되는 이들 세포 간 접착 신호 중 일부는 최근 분화 및 신생물2둘 다에 의해 공유되는 것으로 밝혀졌다. 여기서, 우리는 마우스 유방 상피 세포주, HC11 및 EpH4의 두 가지 대표적인 유형에서 분화의 유도 및 평가 방법을 기술한다.
HC11 마우스 유방 상피 세포주는 상피 세포 분화의 연구에 유용한 모델을 제공할 수 있다. HC11 세포는 COMMA-1D 유래 세포주이며, 임신 중발/c 마우스3의유선에서 유래한다. 다른 COMMA-1D 유도체 클론과 달리, HC11 클론은 유생 호르몬에 의한 내인성 β-카제인 유전자의 체외 유도에 대한 다른 세포 유형과의 외인성 세포 간 매트릭스 또는 동조를 위한 요건이 없다3. 이러한 세포주는 정상 유방 상피의 중요한 특성을 유지했기 때문에 분화 연구에서 광범위하게 사용되어 왔다: HC11 세포는 클리어된 유방 지방 패드4에서덕트 상피를 부분적으로 재구성할 수 있다. 더욱이, 그들은 H이드로코르티손 또는 덱사메타손과 같은 스테로이드의 존재에서 플라스틱 페트리 접시 표면에 부착된 합류로 성장하면 2차원(2D) 배양물에서 분화할 수 있으며, 이외에도I은술린과 P롤락틴(HIP 배지)이 결여되어 표피 성장 인자(EGF), 분화 억제제5,6,7. 이러한 조건하에서 HC11 세포는 β-카제인 및 WAP와 같은 우유 단백질을 생성하며, 이는 유도 후 4일 이내에 서양 블로팅에 의해 검출됩니다. 동시에, HC11 세포의 부분은 초보적인 유방 선과 같은 구조를 형성하여 “돔”이라고 불리는 지형적 방식으로. 돔은 유도 후 4-5일 동안 볼 수 있으며 점차 적으로 크기가 10일까지 증가하고, β-카제인 생산량의 증가와 함께8. 흥미롭게도, HC11 세포는 돌연변이 p539를소유하고, 따라서 전뇌성 상태를 나타낸다. 이러한 이유로, HC11 모델은 동일한 세포 시스템에서 신생물과 함께 분화의 신호 네트워크를 연구하는 데 이상적입니다.
EPH4 세포, IM-2 세포의 유도체는, 원래 임신 중 발브/c마우스(10)로부터분리된 자발적으로 불멸의 마우스 유방 선 상피 세포로부터 유래된 비종양성 세포주이다. EpH4 세포는 2D 배양에서 연속상피 단층을 형성하지만 선형구조(10,11)로분화하지 는 않는다. 그러나, EHS 마우스 육종세포(12)에 의해 생성된 세포외 매트릭스 단백질의 혼합물로 이루어진 물질의 3D 성장에 이어(EHS 매트릭스, 매트릭스, 또는 마트리겔, 물질표참조), HIP를 가진 자극 이외에, EpH4 세포는 유방선 분화의 초기 단계를 재차화할 수 있다. 이러한 조건하에서 EpH4 세포는 심근 기저 극성과 중공 루멘을 나타내는 스페로이드 (유방 골격이라고도 함)를 형성하며, 수유 유방 상피 세포와 유사한 우유 단백질 β-카제인 및 WAP를 생성 할 수 있습니다. 미분화되는 HC11 세포와는 달리, 일부 발현 중간엽마커(13)EpH4 세포는 순수한 발광형태(14)를나타낸다. EpH4 세포는 또한 덱사메타손, 인슐린 및 프롤락틴15를통한 자극을 통해 2D 배양에서 우유 단백질을 생산하는 것으로 보고되었다. 그러나, 이 접근은 3D 문화에서 유방 동맥 미세 환경을 모방하는 규정 효력의 연구 결과 배제합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
HC11 세포는 신생물 형형과 함께 분화 연구에 이상적입니다. 추가적인 이점은 HC11 세포가 다양한 유전자를 발현하기 위해 Mo-MLV 기반 레트로바이러스 벡터로 쉽게 감염될 수 있다는 것입니다. 우리의 손에, EpH4 세포는 HC112보다는 동일 retroviral 벡터로 감염하는 것을 더 어려웠습니다.
세포 대 세포 접촉 및 성장 체포는 HC11 세포 분화를 위한 중요한 전제 조건입?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HC11 세포주들은 D. 메디나 박사(휴스턴, 텍사스 주)에 의해 친절하게 제공되었습니다. 저자는 많은 시약과 가치있는 제안에 대한 퀸즈 대학의 박사 앤드류 크레이그에 감사드립니다. EpH4 세포는 C. Roskelley 박사 (UBC, 밴쿠버)의 선물이었습니다. Colleen Schick은 3D 문화 연구를 위한 우수한 기술 지원을 제공했습니다.
캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC), 캐나다 보건 연구 기관 (CIHR), 캐나다 유방암 재단 (CBCF, 온타리오 지부), 캐나다 유방암 연구 연합의 재정 지원 , 우수의 온타리오 센터, 유방암 액션 킹스턴 (BCAK) 및 LR에 보조금을 통해 클레어 넬슨 유증 기금은 감사하게 인정된다. CIHR, CBCF, BCAK 및 암 연구 학회 Inc.의 보조금 지원을 받은 PTG는 캐나다 연구 위원장, 캐나다 혁신 재단, CIHR, NSERC 및 캐나다 암 학회가 후원합니다. MN은 NCIC에서 학제 암 연구에서 테리 폭스 교육 프로그램에서 학생, 대학원 상 (QGA), 그리고 여왕의 대학에서 학장상에 의해 지원되었다. MG는 미국 육군 유방암 프로그램, 온타리오 주 연구 혁신부 및 퀸즈 대학의 자문 연구위원회에서 박사 후 펠로우십을 지원받았습니다. VH는 CIHR과 협력하여 테리 폭스 재단 교육 프로그램에서 CBCF 박사 펠로우십과 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었습니다. 하나드 아단은 NSERC 여름 학생의 수혜자였다. BS는 퀸즈 대학 대학원 상에 의해 지원되었다.
Materials
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
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