우리는 2개의 유방 상피 선, HC11 및 EpH4의 분화 유도를 위한 기술을 기술합니다. 둘 다 우유 단백질을 생성하기 위하여 태아 송아지 송아지 혈청, 인슐린 및 prolactin를 요구하는 동안, EpH4 세포는 3 차원 문화에서 유방구로 완전히 분화할 수 있습니다. 이러한 상보적인 모델은 분화 및 신생물의 신호 환전 연구에 유용하다.
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방법 논문
마우스 유방 상피 HC11 및 EpH4 세포의 분화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Cadherins는 신생물뿐만 아니라 세포 분화의 조절에 중요한 역할을합니다. 여기에서 우리는 2개의 마우스 유방 상피 세포주, HC11 및 EpH4의 분화의 유도의 기원 그리고 방법 및 유방 선 발달 및 신생물 변환의 상호 보완적인 단계를 공부하기 위하여 그들의 사용을 기술합니다.
HC11 마우스 유방 상피 세포주는 임신 한 Balb / c 마우스의 유선에서 유래. 태아 송아지 혈청 및 H이드로코르티손, I은린및 P롤락틴(HIP 배지)을 함유하는 배지에서 플라스틱 페트리 접시 표면에 부착된 합류로 성장하면 차별화된다. 이러한 조건하에서 HC11 세포는 모유 단백질 β-카제인과 유청 산성 단백질(WAP)을 생산하며, 수유 유방 상피 세포와 유사하며, "돔"이라고 불리는 초보적인 유선 구조를 형성합니다.
EpH4 세포주는 임신한 Balb/c 마우스로부터 분리된 자발적으로 불멸의 마우스 유방 선 상피 세포로부터 유래되었다. HC11과 달리 EpH4 세포는 HIP 배지에서 3차원(3D) 성장 조건하에서 배양할 때 스페로이드(맘모스피어라고도 함)로 완전히 분화할 수 있습니다. 세포는 트립시네화되고, 엥겔브레스-홀름-스웜(EHS) 마우스 육종 세포에 의해 생성된 세포외 매트릭스 단백질의 혼합물로 구성된 20% 매트릭스에서 부유하고, 플라스틱 페트리 접시 또는 멀티웰 플레이트를 코팅하는 농축 매트릭스 층 위에 도금되고, 10% 매트릭스 함유 HIP 배지의 층으로 덮여 있다. 이러한 조건하에서 EpH4 세포는 정점 기저 극성, 중공 루멘을 나타내는 중공 스페로이드를 형성하고 β-카제인 및 WAP를 생성합니다.
이러한 기술을 사용하여, 우리의 결과는 카데린 / Rac 신호의 강도가 HC11 세포의 분화에 중요하다는 것을 입증했다. Rac1은 분화에 필요하고 활성 RacV12의 낮은 수준은 분화를 증가시키는 반면, 높은 RacV12 레벨은 신생물을 유도하면서 분화를 차단한다. 대조적으로, EpH4 세포는 RacV12의낮은 수준에 의해 억제되는 유방 상피 분화에 있는 초기 단계를 나타냅니다.
서론
일반적인 조직 또는 종양에서, 세포는 3차원 조직에서 그들의 이웃에 접착을 위한 광대한 기회를 가지고 있고, 이것은 고밀도 세포 성장에 의해 배양에서 모방됩니다. 세포 대 세포 접착은 주로 세포 및 조직 구조를 정의하는 카데린 수용체를 통해 매개됩니다. 흥미롭게도, 최근에 는 카데린이 특히 생존 신호1에서신호 변환에 강력한 역할을한다는 것을 입증되었습니다. 역설적으로, 카데린으로부터 방출되는 이들 세포 간 접착 신호 중 일부는 최근 분화 및 신생물2둘 다에 의해 공유되는 것으로 밝혀졌다. 여기서, 우리는 마우스 유방 상피 세포주, HC11 및 EpH4의 두 가지 대표적인 유형에서 분화의 유도 및 평가 방법을 기술한다.
HC11 마우스 유방 상피 세포주는 상피 세포 분화의 연구에 유용한 모델을 제공할 수 있다. HC11 세포는 COMMA-1D 유래 세포주이며, 임신 중발/c 마우스3의유선에서 유래한다. 다른 COMMA-1D 유도체 클론과 달리, HC11 클론은 유생 호르몬에 의한 내인성 β-카제인 유전자의 체외 유도에 대한 다른 세포 유형과의 외인성 세포 간 매트릭스 또는 동조를 위한 요건이 없다
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프로토콜
1. 도금 HC11 셀
- 멸균 기술을 사용하는 층류 후드에서 HC11 세포 배지의 50 mL로 병을 제조합니다: RPMI-1640 과 10% 태아 소 혈청 (FBS), 5 μg/mL 인슐린, 및 10 ng/mL EGF (재료 표참조).
- 접시 3 cm 페트리 접시 당 약 400,000 세포 : HC11 매체에 20 3cm 접시에 두 개의 10cm, 50 % confluent 페트리 접시를 전달합니다. 세포는 잘 퍼져 있어야하지만 건조는 피해야합니다.
- 진공 펌프를 사용하여 배지를 플라스크에 흡인합니다.
- 10cm 플레이트당 트립신 250 μL(재료 표참조)을 추가합니다. 트립신을 확산하고 부착 된 세포를 빼내기 위해 수평으로 유지하면서 접시를 양쪽에서 소용돌이치고 충돌하십시오.
- 4x 목적을 가진 위상 대조 현미경 검사법에서 관찰하기 위하여 세포가 파이펫팅의 앞에 가장자리에서 분리하기 시작했는지 확인합니다.
- 멸균 된 9 인치 파스퇴르 피펫에서 HC11 배지의 약 1.5 mL을 흡인하고 세포에 수직으로 분출합니다. 모든 세포를 빼내기 위해 분출하면서 페트리 접시를 돌이키십시오. 당신은 세포의 건조를 피하기 위해 빠르게 작동해야합니다.<....
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결과
상피 세포와 지방세포의 분화가 카데린2의합류와 결합을 필요로 한다는 것은 오랫동안 알려져 왔다. 당사와 다른 사람들은 세포 간 부착 및 E-또는 N-카데린 및 카데린-11의 결합을 입증했습니다. 배양 된 세포의 합류와 함께 발생, 작은 GTPases Rac 및 세포 분열 제어 단백질 (Cdc42)의 활성의 극적인 증가를 트리거,이 과정은 인터류킨 -6 (IL6) 가족 사이토 카인 및 Stat3의 활성화로 이어진다 (전사-3의 신호 트랜스듀서 및 활성제16,17)18, 18. 18. 18. cadherin/Rac/IL6/Stat3 통로의 많은 분대가 분화 및 신생물 변환에 모두 참여할 수 있기 때문에, 그들은 이 두 정.......
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토론
HC11 세포는 신생물 형형과 함께 분화 연구에 이상적입니다. 추가적인 이점은 HC11 세포가 다양한 유전자를 발현하기 위해 Mo-MLV 기반 레트로바이러스 벡터로 쉽게 감염될 수 있다는 것입니다. 우리의 손에, EpH4 세포는 HC112보다는 동일 retroviral 벡터로 감염하는 것을 더 어려웠습니다.
세포 대 세포 접촉 및 성장 체포는 HC11 세포 분화를 위한 중요한 전제 조건입니다. 따라서, 세포층을 통해 균일한 분화를 달성하기 위해서는, 파종시에 페트리 접시 내의 세포의 균일한 분포를 달성하는 것이 중요하다. 이는 분화의 정량이 필요한 경우에 특히 중요합니다. 트립시니화는 단일 세포 현탁액이 달성되고 세포가 조작으로 인해 생존력을 잃지 않도록 최적화되어야 합니다.
트립시니화되는 세포는 높은 밀도로 성장한 세포가 서로 강하게 부착되는 경향이 있기 때문에 하위 (50-70%)이어.......
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공개 사항
저자는 공개할 충돌이 없습니다.
감사의 글
HC11 세포주들은 D. 메디나 박사(휴스턴, 텍사스 주)에 의해 친절하게 제공되었습니다. 저자는 많은 시약과 가치있는 제안에 대한 퀸즈 대학의 박사 앤드류 크레이그에 감사드립니다. EpH4 세포는 C. Roskelley 박사 (UBC, 밴쿠버)의 선물이었습니다. Colleen Schick은 3D 문화 연구를 위한 우수한 기술 지원을 제공했습니다.
캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC), 캐나다 보건 연구 기관 (CIHR), 캐나다 유방암 재단 (CBCF, 온타리오 지부), 캐나다 유방암 연구 연합의 재정 지원 , 우수의 온타리오 센터, 유방암 액션 킹스턴 (BCAK) 및 LR에 보조금을 통해 클레어 넬슨 유증 기금은 감사하게 인정된다. CIHR, CBCF, BCAK 및 암 연구 학회 Inc.의 보조금 지원을 받은 PTG는 캐나다 연구 위원장, 캐나다 혁신 재단, CIHR, NSERC 및 캐나다 암 학회가 후원합니다. MN은 NCIC에서 학제 암 연구에서 테리 폭스 교육 프로그램에서 학생, 대학원 상 (QGA), 그리고 여왕의 대학에서 학장상에 의해 지원되었다. MG는 미국 육군 유방암 프로그램, 온타리오 주 연구 혁신부 및 퀸즈 대학의 자문 연구위원회에서 박사 후 펠로우십을 지원받았습니다. VH는 CIHR과 협력하여 테리 폭스....
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재료
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참고문헌
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- Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiat....
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