Differentiering af mus bryst epitel HC11 og EpH4 Celler
Summary
Vi beskriver teknikker til differentiering induktion af to bryst epitellinjer, HC11 og EpH4. Mens begge kræver føtal kalv serum, insulin, og prolaktin til at producere mælkeproteiner, EpH4 celler kan fuldt ud differentiere sig i mammsfærer i tre-dimensionel kultur. Disse komplementære modeller er nyttige til undersøgelser af signaltransduktion af differentiering og neoplasi.
Abstract
Cadherins spiller en vigtig rolle i reguleringen af celledifferentiering samt neoplasi. Her beskriver vi oprindelsen og metoderne til induktion af differentiering af to musebryst epitelcellelinjer, HC11 og EpH4, og deres anvendelse til at studere komplementære stadier af mælkekirtlen udvikling og neoplastiske transformation.
DEN HC11 mus bryst epitelcelle linje stammer fra mælkekirtlen af en gravid Balb / c mus. Det differentierer, når de dyrkes til sammenløb knyttet til en plast Petri skål overflade i medium, der indeholder føtal kalv serum og Hydrocortison, jegnsulin og Prolactin (HIP medium). Under disse betingelser producerer HC11-celler mælkeproteiner β-kasein og vallesyreprotein (WAP), svarende til diegivende mælkeepitelceller, og danner rudimentære mælkekirtellignende strukturer kaldet “kupler”.
Den EpH4 cellelinje blev afledt af spontant udødeliggjort mus mælkekirtlen epitel epitel celler isoleret fra en gravid Balb / c mus. I modsætning til HC11, EpH4 celler kan fuldt ud differentiere sig i sfæller (også kaldet mammosfærer), når dyrket under tre-dimensionelle (3D) vækstbetingelser i HIP medium. Celler trypsiniseres, suspenderes i en 20% matrix bestående af en blanding af ekstracellulære matrix proteiner produceret af Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus sarkomceller, belagt oven på et lag koncentreret matrix belægning en plast petriskål eller flerbrøndplade, og dækket med et lag på 10% matrix-holdige HIP medium. Under disse betingelser danner EpH4-celler hule sfæller, der udviser apical-basal polaritet, en hul lumen og producerer β-kasein og WAP.
Ved hjælp af disse teknikker, vores resultater viste, at intensiteten af cadherin / Rac signal er afgørende for differentiering af HC11 celler. Mens Rac1 er nødvendig for differentiering og lave niveauer af aktiveret RacV12 øge differentiering, høje RacV12 niveauer blokere differentiering samtidig inducerende neoplasi. I modsætning hertil repræsenterer EpH4-celler en tidligere fase i mælkeepiteldifferentiering, som hæmmes af selv lave niveauer af RacV12.
Introduction
I normale væv eller tumorer, celler har omfattende muligheder for vedhæfte til deres naboer i en tre-dimensionel organisation, og dette efterlignes i kultur ved høj tæthed cellevækst. Celle-til-celle vedhæftning formidles hovedsageligt gennem cadherin receptorer, som definerer celle og væv arkitektur. Interessant, det blev for nylig vist, at cadherins også spille en stærk rolle i signal transduktion, især i overlevelse signalering1. Paradoksalt nok, nogle af disse celle-til-celle vedhæftning signaler stammer fra cadherins blev for nylig anset for at være delt af både differentiering og neoplasi2. Her beskriver vi metoder til induktion og vurdering af differentiering i to repræsentative typer af musebryst epitelcellelinjer, HC11 og EpH4.
HC11 mus bryst epitelcellelinje kan give en nyttig model for studiet af epitelcelle differentiering. HC11 celler er en KOMMA-1D-afledt cellelinje, der stammer fra mælkekirtlen i en midgravid Balb/c mus3. I modsætning til andre KOMMA-1D-afledte kloner har HC11-klonen ikke noget krav om udefrakommende tilsat ekstracellulær matrix eller samdyrkning med andre celletyper til in vitroinduktion af det endogene β-kaseingen ved laktogene hormoner3. Denne cellelinje er blevet anvendt i udstrakt grad i differentieringsundersøgelser, fordi den har bevaret vigtige egenskaber ved det normale mælkeepitel: HC11-celler kan delvist rekonstruere kanalepitel i en renset mælkefedtpude4. Desuden, de kan differentiere i en to-dimensionel (2D) kultur, når de dyrkes til sammenløb knyttet til en plast Petri skål overflade i overværelse af et steroid som Hydrocortison eller Dexamethason, ud over jegnsulin og Prolactin (HIP medium) mangler epidermal vækstfaktor (EGF), en hæmmer af differentiering5,6,7. Under disse omstændigheder producerer HC11-celler mælkeproteiner såsom β-kasein og WAP, som kan påvises ved vestlig blotting inden for 4 dage efter induktion. Samtidig danner en del af HC11 celler rudimentære mælkekirtellignende strukturer, der kaldes “kupler” på en stokastisk måde. Kupler er synlige 4-5 dage efter induktion og gradvist stigning i størrelse op til dag 10, samtidig med en stigning i β-kasein produktion8. Interessant, HC11 celler besidder mutant p539, og derfor repræsenterer en præneoplastisk tilstand. Af denne grund er HC11-modellen velegnet til at studere signalnetværk af differentiering i forbindelse med neoplasi i samme cellesystem.
EpH4 celler, et derivat af IM-2 celler, er en nontumorigenic celle linje oprindeligt stammer fra spontant udødeliggjort mus mælkekirtlen epitel epitel epitelceller isoleret fra en mid-gravid Balb /c mus10. EpH4 celler danner kontinuerlig epitelmonolag i 2D-kultur, men skelner ikke i kirtellignende strukturer10,11. Men efter 3D-vækst i et materiale, der består af en blanding af ekstracellulære matrix proteiner produceret af EHS mus sarkomceller12 (EHS matrix, matrix, eller Matrigel, se Tabel over materialer),ud over stimulation med HIP, EpH4 celler kan opsummere de indledende faser af mælkekirtlen differentiering. Under disse betingelser danner EpH4-celler sfæller (også kaldet mammøsfærer), der udviser apical-basal polaritet og et hult lumen, og er i stand til at producere mælkeproteiner β-kasein og WAP, svarende til lakterende mælkeepitelceller. I modsætning til HC11 celler, som er udifferentierede, og nogle udtrykke mesenkymale markører13, EpH4 celler udviser en rent luminal morfologi14. EpH4 celler er også blevet rapporteret til at producere mælkeproteiner i 2D-kultur gennem stimulation med dexamethason, insulin, og prolaktin15. Men, denne tilgang udelukker undersøgelse af lovgivningsmæssige virkninger, der efterligner mælkekirtlen mikromiljø i 3D-kultur.
Protocol
Representative Results
Discussion
HC11 celler er velegnede til studiet af differentiering i forbindelse med neoplastisk transformation. En ekstra fordel er, at HC11 celler er let inficeres med Mo-MLV-baserede retrovirale vektorer til at udtrykke en række gener. I vores hænder, EpH4 celler var vanskeligere at inficere med de samme retrovirale vektorer end HC112.
Celle-til-celle kontakt og vækst anholdelse er centrale forudsætninger for HC11 celle differentiering. Således, for at opnå ensartet diffe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den HC11 celle linje blev venligt leveret af Dr. D. Medina (Houston, TX). Forfatterne er taknemmelige for Dr. Andrew Craig fra Queen’s University for mange reagenser og værdifulde forslag. EpH4 celler var en gave fra Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick ydede fremragende teknisk bistand til 3D-kulturstudier.
Den finansielle bistand fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), den canadiske Institutes of Health Research (CIHR), den canadiske Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario kapitel), den canadiske Breast Cancer Research Alliance , Ontario Centre of Excellence, Breast Cancer Action Kingston (BCAK) og Clare Nelson arv fond gennem tilskud til LR er taknemmeligt anerkendt. BE modtaget tilskud støtte fra CIHR, CBCF, BCAK og Cancer Research Society Inc. PTG er støttet af en Canada Research Chair, Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC og Canadian Cancer Society. MN blev støttet af et studenterprogram fra Terry Fox Training Program i Transdisciplinary Cancer Research fra NCIC, en Graduate award (QGA), og en Dean’s Award fra Queen’s University. MG blev støttet af postdoc stipendier fra den amerikanske hær Breast Cancer Program, Ministeriet for Forskning og Innovation i provinsen Ontario og det rådgivende forskningsudvalg for Queen’s University. VH blev støttet af en CBCF ph.d.-stipendium og en postdoc stipendium fra Terry Fox Foundation Training Program i Tværfaglig Cancer Research i partnerskab med CIHR. Hanad Adan var modtager af et NSERC sommerstudenteri. BS blev støttet af en Queen’s University graduate award.
Materials
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
- Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
- Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
- Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
- Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
- Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
- Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).
- Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).
- Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).
- Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
- Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
- Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
- Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).
- Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
- Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).
- Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
- Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
- Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
- Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
- Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
- Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
- Starova, B. . Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).
- Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
- Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Hoskin, V. C. . A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).
- Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
- Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
- Cass, J. . Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).
