マウス乳房上皮HC11細胞とEpH4細胞の分化
Summary
我々は、2つの胸上皮線HC11およびEpH4の分化誘導のための技術を記述する。どちらも乳タンパク質を産生するために胎児の子牛血清、インスリン、プロラクチンを必要としますが、EpH4細胞は3次元培養でマンモスフィアに完全に分化することができます。これらの相補モデルは、分化および新生物のシグナル伝達研究に有用である。
Abstract
カドヘリンは、細胞分化および腫瘍の調節において重要な役割を果たす。ここでは、2つのマウス胸上皮細胞株HC11とEpH4の分化誘導の起源と方法、および乳腺の発達と腫瘍性形質転換の相補的段階を研究するためのその使用について説明する。
HC11マウスの乳房上皮細胞系は、妊娠中のバルブ/cマウスの乳腺に由来する。これは、胎児の子牛血清およびHイドロコルチゾン、InsulinおよびPロラクチン(HIP培地)を含む培地中のプラスチックペトリ皿表面に結合するように成長した場合に分化する。これらの条件下で、HC11細胞は乳タンパク質βカゼインおよび乳清酸性タンパク質(WAP)を産生し、乳腺上皮細胞の授乳と同様に、初歩的な乳腺様構造を形成し、「ドーム」と呼ばれます。
EpH4細胞株は、妊娠中のバルブ/cマウスから単離された自発的に不死化したマウス乳腺上皮細胞に由来した。HC11とは異なり、EPH4細胞はHIP培地で3次元(3D)増殖条件下で培養すると、スフェロイド(マンモスフィアとも呼ばれる)に完全に分化することができます。細胞はトリプシン化され、エンゲルブレス・ホルム・スウォーム(EHS)マウス肉腫細胞によって産生される細胞外マトリックスタンパク質の混合物からなる20%マトリックスで懸濁し、プラスチックペトリ皿またはマルチウェルプレートをコーティングする濃縮マトリックスの層の上にメッキし、10%マトリックス含有HIP培地の層で覆われる。これらの条件下で、EpH4細胞は、尖面基底極性、中空ルーメンを示し、βカゼインおよびWAPを産生する中空回転楕円体を形成する。
これらの技術を用いて、我々の結果は、カドヘリン/Racシグナルの強度がHC11細胞の分化に重要であることを実証した。Rac1は分化に必要であり、活性化されたRacV12の低レベルは分化を増加させるが、高いRacV12レベルは新生物を誘導しながら分化をブロックする。対照的に、EpH4細胞は乳腺上皮分化における初期段階を表し、これは低レベルのRacV12によっても阻害される。
Introduction
正常な組織や腫瘍では、細胞は3次元組織で隣人との接着の広範な機会を有し、これは高密度細胞増殖によって培養中に模倣される。細胞間接着は、主にカドヘリン受容体を介して媒介され、細胞および組織の構造を定義する。興味深いことに、カドヘリンは、特に生存シグナル伝達1において、シグナル伝達においても強力な役割を果たしていることを最近実証した。逆説的に、カドヘリンから発せられるこれらの細胞間接着シグナルの一部は、最近、分化と新生物2の両方によって共有されることがわかった。ここでは、マウス胸上皮細胞株の2つの代表的なタイプHC11およびEpH4における分化誘導および評価の方法を記載する。
HC11マウスの胸上皮細胞株は、上皮細胞分化の研究に有用なモデルを提供することができる。HC11細胞は、妊娠中のバルブ/cマウスの乳腺由来のCOMMA-1D由来細胞株である3。他のCOMMA−1D誘導体クローンとは対照的に、HC11クローンは、発泡性ホルモン3による内因性β-カゼイン遺伝子のインビトロ誘導のために他の細胞型と外因性付加された細胞外マトリックスまたは共培養のための要件を有さない。この細胞株は、正常乳上皮の重要な特徴を保持しているため分化試験で広く使用されている:HC11細胞は、乳腺脂肪パッド4をクリアして、そのダクト上皮を部分的に再構成することができる。また、Hイドロコルチゾンやデキサメタゾンなどのステロイドの存在下でプラスチックペトリ皿表面に結合して成長した場合に2次元(2D)培養で分化することができ、さらに、表皮成長因子(EGF)を欠く上皮成長因子(EGF)に加えて、5、6、7の異化阻害薬である。これらの条件下では、HC11細胞はβカゼインやWAPなどの乳タンパク質を産生し、これは誘導後4日以内にウェスタンブロッティングによって検出可能である。同時に、HC11細胞の一部は、ストカスティックな方法で「ドーム」と呼ばれている初歩的な乳腺様構造を形成する。ドームは、誘導後4〜5日目に見え、徐々に10日目までサイズが増加し、βカゼイン産生の増加に伴って8.興味深いことに、HC11細胞は変異型p539を有し、したがって前生性状態を表す。このため、HC11モデルは、同じ細胞系の新生物と組み合わせて分化のシグナリングネットワークを研究するのに理想的です。
EPH4細胞は、IM−2細胞の誘導体であり、元来、妊娠中のバルブ/cマウス10から単離された自発的に不死化マウス乳腺上皮細胞に由来する非腫瘍性細胞株である。EpH4細胞は2D培養で連続上皮単層を形成するが、腺様構造10,11に分化しない。しかし、EHSマウス肉腫細胞12によって産生される細胞外マトリックスタンパク質の混合物からなる材料での3D増殖に続いて(EHSマトリックス、マトリックス、またはマトリゲル、材料の表を参照)、HIPによる刺激に加えて、EpH4細胞は乳腺分化の初期段階を再現することができる。これらの条件下では、EpH4細胞は、吸盤基底極性および中空腔を示す回転楕円体(マンモスフィアとも呼ばれる)を形成し、乳タンパク質β-カゼインおよびWAPを産生し得る。未分化化しているHC11細胞とは対照的に、幾つかは間葉マーカー13を発現するが、EpH4細胞は純粋に発光形態14を示す。EpH4細胞はまた、デキサメタゾン、インスリン、およびプロラクチン15による刺激を通じて2D培養で乳タンパク質を産生することが報告されている。しかし、このアプローチは、3D培養における乳腺微小環境を模倣する調節効果の研究を妨げる。
Protocol
Representative Results
Discussion
HC11細胞は、新生物の形質転換と共に分化の研究に理想的に適しています。さらに、HC11細胞はMo-MLVベースのレトロウイルスベクターに容易に感染し、様々な遺伝子を発現できることが利点です。私たちの手では、EpH4細胞はHC112よりも同じレトロウイルスベクターに感染することがより困難であった。
細胞間接触および増殖停止は、HC11細胞分化のための?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HC11細胞株はD.メディナ博士(テキサス州ヒューストン)によって親切に提供された。著者らは、多くの試薬と貴重な提案のためにクイーンズ大学のアンドリュー・クレイグ博士に感謝しています。EpH4細胞は、C.ロスケリー博士(バンクーバーのUBC)からの贈り物でした。コリーン・シックは、3D文化研究のための優れた技術支援を提供しました。
カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)、カナダ健康研究所(CIHR)、カナダ乳癌財団(CBCF、オンタリオ支部)、カナダ乳癌研究同盟の資金援助オンタリオ・センター・オブ・エクセレンス、乳がんアクションキングストン(BCAK)、クレア・ネルソンのLRへの助成金による遺贈基金は、感謝の念をうっていいます。CIHR、CBCF、BCAK、がん研究協会から助成金を受けたPTGは、カナダイノベーション財団、CIHR、NSERC、カナダ癌学会のカナダ研究委員長が支援しています。MNは、NCICの学際的がん研究におけるテリー・フォックス・トレーニング・プログラムの学生シップ、大学院賞(QGA)、クイーンズ大学の学部長賞によって支援されました。MGは、アメリカ陸軍乳がんプログラム、オンタリオ州の研究イノベーション省、クイーンズ大学の諮問研究委員会の博士研究員によって支援されました。VHは、CIHRと提携して、学際癌研究におけるテリー・フォックス財団研修プログラムのCBCF博士フェローシップと博士研究員によって支援されました。ハナド・アダンはNSERCの夏の学生シップの受給者でした。BSはクイーンズ大学の大学院賞に支えられていました。
Materials
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
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