Hiv Hedeflerinin Antikorbağımlı Hücresel Fagositoz Sataşanında Kullanılmak Üzere İnsan Anne Sütünden Lökositlerin İzolasyon
Summary
Anne sütü insan immün yetmezlik virüsü (HIV) iletir, ancak HIV enfekte anneler tarafından emzirilen bebeklerin sadece ~% 15 enfekte olur. Anne sütüyle beslenen bebekler günlük ~105−108 maternal lökosit yutmaktadır, ancak bu hücreler incelenmiştir. Burada anne sütü lökositlerinin izolasyonu ve fagositik kapasitelerinin analizini anlatıyoruz.
Abstract
Antiretroviral ilaçların yokluğunda bile, HIV ile enfekte olmuş anneler tarafından emzirilen bebeklerin sadece ~% 15 enfekte olur, anne sütü güçlü bir koruyucu etkisi düşündüren (BM). Temiz suya erişim ve uygun bebek formülü güvenilir olmadığı sürece, WHO HIV bulaşmış anneler için emzirmenin durdurulmasını önermez. Bm iletimini azaltmak için çok sayıda faktör büyük olasılıkla birlikte çalışır. Anne sütüyle beslenen bebekler günlük ~105−108 maternal lökosit yutmaktadır, ancak bu hücrelerin BM’nin antiviral niteliklerine katkısı büyük ölçüde belirsizdir. HIV hedeflerine karşı BM fagositleri tarafından en önemli ve yaygın doğuştan gelen immün yanıtlardan biri olan antikorbağımlı hücresel fagositoz (ADCP). Hücreler emzirmenin çeşitli aşamalarında elde edilen 5 insan BM örneğinden izole edildi. İzolasyon, süt yağının dikkatli bir şekilde çıkarılması ve hücre peletinin tekrartekrar yıkanması ile nazik santrifüj yoluyla gerçekleştirildi. HIV zarfı (Env) epitop ile kaplanmış floresan boncuklar ADCP analizinde hedef olarak kullanılmıştır. Hücreler lökositleri tanımlamak için CD45 yüzey belirteci ile boyandı. BU ADCP aktivitesi kontrol deneyleri yukarıda önemli ve tekrarlanabilir bir HIV özgü antikor 830A kullanarak bulundu.
Introduction
İnsan anne sütü (BM) anne hücrelerinden oluşur >90% canlı1. Hücre bileşimi güçlü emzirme aşamasında etkilenir, anne ve bebeğin sağlık durumu, ve bireysel varyasyon, hangi kötü anlaşılmış kalır1,2,3,4. BM~103−105 lökosit/mL içerdiği göz önüne alındığında, anne sütüyle beslenen bebeklerin günlük5~105−108 maternal lökosit yuttukları tahmin edilebilir. Çeşitli in vivo çalışmalar, maternal lökositlerin bebeğe kritik bağışıklık sağladığını ve bu ilk yutma alanlarının çok ötesinde fonksiyonel olduğunu göstermiştir5,6,7,8 ,9,10,11. Bebek tarafından yutulan tüm anne kaynaklı hücreler yanında bağışıklık fonksiyonları gerçekleştirmek veya bebeğin kendi lökositler telafi etmek için potansiyele sahip12.
İnsan immün yetmezlik virüsünün (HIV) anne-çocuk iletimi (MTCT) kaynak sınırlı ülkelerde bir kriz olmaya devam etmektedir. İshal ve solunum yolu hastalıkları kaynak sınırlı ülkelerde bebekler arasında mortalite önemli oranlarda sorumlu olduğundan ve bu hastalıklar önemli ölçüde özel emzirme ile azalır, HIV enfekte anneler için faydaları emzirme çok riskleri ağır basar13,14,15. Temiz su ve uygun bebek formülü erişim güvenilir olmadığı sürece, WHO HIV enfekte anneler için emzirme kesilmesini önermez16. BM üzerinden yılda yaklaşık 100.000 MTCT meydana gelir; henüz, hiv-enfekte anneler tarafından emzirilen bebeklerin sadece ~ 15% enfekte olur, BM güçlü bir koruyucu etkisi düşündüren17,18,19,20,21. Çok sayıda faktör büyük olasılıkla iletimi önlemek için birlikte çalışır. Daha da önemlisi, BM’de HIV spesifik antikorlar (Abs) azaltılmış MTCT ve / veya HIV enfeksiyonu22,23azaltılmış bebek ölümü ile ilişkili olmuştur. Bm’nin hücresel fraksiyonunun antiviral niteliklerine katkısı büyük ölçüde belirsizdir.
Birçok Abs immünglobulin molekülünün ‘sabit’ bölgesi tarafından aracılık anti-viral faaliyetleri çeşitli kolaylaştırmak, kristalize parça (Fc), Fc reseptörleri ile etkileşim yoluyla (FcR) hemen hemen tüm doğuştan gelen bağışıklık hücreleri üzerinde bulunan, hemen hemen hepsi insan BM24bulunur. Antikorbağımlı hücresel fagositoz (ADCP) viral enfeksiyonların temizlenmesi için gerekli olarak gösterilmiştir ve HIV MTCT önlenmesi durumunda understudied olmuştur25,26,27, 28.000 , 29. BM fagositleri tarafından ADCP aktivitesinin HIV MTCT’sinin önlenmesine olası katkısı hakkında bilginin azlığı göz önüne alındığında, hücreleri insan BM’den izole etmek için sıkı bir yöntem geliştirmeyi amaçladık. BM emzirmenin çeşitli aşamalarında elde edilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tanımlanan ADCP aktivitesini ölçmek için akış sitometrisi bazlı teknik ilk olarak 201130 yılında tanımlanmış ve o zamandan beri sağlam olduğu kanıtlanmıştır ve 80’den fazla çalışmada belirtilmiştir. Burada açıklanan protokol, bu tekniği ilk kez birincil BM hücreleriyle kullanılmak üzere uyarlar. BM hücreleri tarafından Fc aracılı işlevsellik önceki çalışmalar büyük ölçüde oksidatif patlamalar veya histoloji tabanlı fagositoz testleri kolostrum izol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sina Dağı’ndaki Icahn Tıp Fakültesi Tıp Bölümü ve Mikrobiyoloji Bölümü’nden Dr. Susan Zolla-Pazner’a makale incelemesi için teşekkür ederiz. NIH/NICHD bu proje için R21 HD095772-01A1 hibe numarası altında fon sağladı. Buna ek olarak, R. Powell Tıp Bölümü, Bulaşıcı Hastalıklar Bölümü, Mount Sinai Icahn Tıp Okulu fonları tarafından desteklendi.
Materials
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
References
- Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
- Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).
- Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).
- Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).
- Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).
- Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).
- Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).
- Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).
- Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).
- Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
- Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer’s Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).
- Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
- Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).
- Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).
- WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).
- World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. , (2016).
- Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
- Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).
- Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).
- Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).
- Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).
- Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).
- Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).
- Ackerman, M., Nimmerjahn, F. . Antibody Fc. , (2014).
- Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).
- Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).
- Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).
- Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
- Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).
- Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).
- Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).
- Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).
- Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).
- Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).
- Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).
- Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).
