Isolamento dei leucociti dal latte materno umano per l'uso in un saggio di fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi sui bersagli HIV
Summary
Il latte materno trasmette il virus dell’immunodeficienza umana (HIV), anche se solo il 15% dei neonati allattati al seno da madri affette da HIV si infetta. I neonati allattati al seno ingeriscono 105x 108 leucociti materni al giorno, anche se queste cellule sono poco studiate. Qui descriviamo l’isolamento del latte materno leucociti e un’analisi della loro capacità fagocitica.
Abstract
Anche in assenza di farmaci antiretrovirali, solo il 15% dei neonati allattati al seno da madri affette da HIV si infetta, suggerendo un forte effetto protettivo del latte materno (BM). A meno che l’accesso all’acqua pulita e la formula per neonati appropriata non siano affidabili, l’OMS non raccomanda la cessazione dell’allattamento al seno per le madri infette dall’HIV. Numerosi fattori probabilmente funzionano in tandem per ridurre la trasmissione di BM. I neonati allattati al seno ingeriscono al giorno 105x 108 leucociti materni, anche se ciò che rimane ampiamente poco chiaro è il contributo di queste cellule alle qualità antivirali della BM. la fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi (ADCP), una delle risposte immunitarie innatee più essenziali e pervasive, da parte dei fagociti BM contro i bersagli HIV. Le cellule sono state isolate da 5 campioni di BM umani ottenuti in varie fasi dell’allattamento. L’isolamento è stato effettuato attraverso una delicata centrifugazione seguita da un’attenta rimozione del grasso di latte e il lavaggio ripetuto del pellet cellulare. Le perle fluorescenti rivestite con inviluppo HIV (Env) epitopo sono state utilizzate come obiettivi per l’analisi di ADCP. Le cellule sono state macchiate con il marcatore di superficie CD45 per identificare i leucociti. È stato scoperto che l’attività ADCP era significativa sopra gli esperimenti di controllo e riproducibilmente misurabile utilizzando un anticorpo specifico dell’HIV 830A.
Introduction
Il latte materno umano (BM) è costituito da cellule materne che sono >90% vitali1. La composizione cellulare è fortemente influenzata dallo stadio di allattamento, dallo stato di salute della madre e del bambino e dalla variazione individuale, che rimane poco compresa1,2,3,4. Dato che la BM contiene 103x 105 leucociti/mL, si può stimare che i neonati allattati al seno ingeriscano 105x 108 leucociti materni al giorno5. Vari studi in vivo hanno dimostrato che i leucociti materni forniscono immunità critica al bambino e sono funzionali ben oltre questi siti di ingestione iniziale5,6,7,8 ,9,10,11. Tutte le cellule di derivazione materna ingerite dal neonato hanno il potenziale per svolgere funzioni immunitarie a fianco o per compensare i leucociti del bambino12.
La trasmissione madre-bambino (MTCT) del virus dell’immunodeficienza umana (HIV) rimane una crisi nei paesi con risorse limitate. Poiché le malattie diarrea e respiratorie sono responsabili di notevoli tassi di mortalità tra i neonati nei paesi con risorse limitate, e queste malattie sono significativamente ridotte dall’allattamento esclusivo al seno, i benefici per le madri infette da HIV l’allattamento al seno superano di gran lunga i rischi13,14,15. A meno che l’accesso all’acqua pulita e la formula per neonati appropriata non siano affidabili, l’OMS non raccomanda la cessazione dell’allattamento al seno per le madri infette da HIV16. Circa 100.000 MTCT tramite BM si verificano ogni anno; tuttavia, solo il 15% dei neonati allattati al seno dalle loro madri infette da HIV si infettano, suggerendo un forte effetto protettivo di BM17,18,19,20,21. Numerosi fattori probabilmente funzionano in tandem per impedire la trasmissione. È importante sottolineare che gli anticorpi specifici per l’HIV (Abs) in BM sono stati correlati alla riduzione dell’MTCT e/o alla riduzione della morte infantile per infezione da HIV22,23. Ciò che rimane in gran parte poco chiaro è il contributo della frazione cellulare di BM alle sue qualità antivirali.
Molti Abs facilitano una varietà di attività anti-virali mediate dalla regione “costante” della molecola di immunoglobulina, il frammento cristallizzabile (Fc), attraverso l’interazione con i recettori Fc (FcR) che si trovano praticamente su tutte le cellule immunitarie innate, praticamente tutte si trovano nell’uomo BM24. La fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi (ADCP) è stata dimostrata come necessaria per lo sgombero delle infezioni virali ed è stata poco studiata nel caso della prevenzione dell’MTCT dell’HIV25,26,27, 28 mi la più del 24 , 29.Data la scarsità di conoscenze sul potenziale contributo dell’attività ADCP da parte dei fagociti BM alla prevenzione della MTCT dell’HIV, abbiamo mirato a sviluppare un metodo rigoroso per isolare le cellule dalla BM umana al fine di intraprendere uno studio di ADCP mediato da cellule da BM ottenuto in varie fasi di allattamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica a flusso di citometria per misurare l’attività ADCP descritta qui è stata descritta per la prima volta nel 201130 e da allora è stata dimostrata robusta e citata in più di 80 studi. Il protocollo qui descritto adatta questa tecnica per l’uso con le cellule BM primarie per la prima volta. Precedenti studi sulla funzionalità mediata da Fc da cellule BM sono stati in gran parte limitati alla misurazione di esplosioni ossidative o analisi di fagocitosi a base di estasi utilizzando cell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la Dott.ssa Susan e il Dipartimento di Microbiologia della Icahn School of Medicine del Monte Sinai per la revisione del manoscritto. Il NIH/NICHD ha fornito finanziamenti per questo progetto con il numero di sovvenzione R21 HD095772-01A1. Inoltre, R. Powell è stato sostenuto da fondi del Dipartimento di Medicina, Divisione delle Malattie Infettive, Icahn School of Medicine del Monte Sinai.
Materials
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
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