عزل الكريات البيض عن حليب الثدي البشري للاستخدام في فحص الفيغوسية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة لأهداف فيروس نقص المناعة البشرية
Summary
وينقل حليب الثدي فيروس نقص المناعة البشرية، على الرغم من أن حوالي 15 في المائة فقط من الرضع الذين يرضعون رضاعة طبيعية من الأمهات المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية يصابون بالعدوى. الرضع الذين يرضعون رضاعة طبيعية تناول ~ 105−108 الكريات البيض الأمومية يوميا، على الرغم من أن هذه الخلايا هي أقل دراسة. هنا نقوم بوصف عزل ة حليب الثدي الكريات البيض وتحليل قدرتها الفصوتية.
Abstract
وحتى في غياب العقاقير المضادة للفيروسات العكوسة، فإن حوالي 15 في المائة فقط من الرضع الذين ترضعهم الأمهات المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية يصابون بالعدوى، مما يشير إلى وجود تأثير وقائي قوي لحليب الثدي. وما لم يكن الحصول على المياه النظيفة وحليب الرضع المناسب موثوقاً به، فإن منظمة الصحة العالمية لا توصي بوقف الرضاعة الطبيعية للأمهات المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية. ومن المرجح أن تعمل عوامل عديدة جنبا إلى جنب للحد من انتقال BM. الرضع الذين يرضعون رضاعة طبيعية تناول ~ 105−108 الكريات البيض الأمومية يوميا، على الرغم من أن ما لا يزال غير واضح إلى حد كبير هو مساهمة هذه الخلايا في الصفات المضادة للفيروسات من BM. في الوقت الحاضر كنا نهدف إلى عزل الخلايا من BM الإنسان من أجل قياس الفيغوسيات الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCP)، وهي واحدة من الاستجابات المناعية الفطرية الأكثر أهمية وانتشاراً، من قبل خلايا الفيغاسضدية BM ضد أهداف فيروس نقص المناعة البشرية. تم عزل الخلايا من 5 عينات BM البشرية التي تم الحصول عليها في مراحل مختلفة من الرضاعة. تم إجراء العزلة عن طريق الطرد المركزي لطيف تليها إزالة دقيقة من الدهون الحليب والغسيل المتكرر من بيليه الخلية. وقد استخدمت حبات الفلورسنت المغلفة بغلاف فيروس نقص المناعة البشرية (Env) كأهداف لتحليل ADCP. كانت الخلايا ملطخة بعلامة سطح CD45 لتحديد الكريات البيض. وتبين أن نشاط برنامج مكافحة المخدرات كان كبيرا فوق تجارب المراقبة ويمكن قياسه بشكل قابل للقياس باستخدام جسم مضاد خاص بفيروس نقص المناعة البشرية 830A.
Introduction
يتكون حليب الثدي البشري (BM) من خلايا الأمومة التي هي > 90٪ قابلة للحياة1. يتأثر تكوين الخلية بشدة بمرحلة الرضاعة، والحالة الصحية للأم والرضيع، والتباين الفردي، الذي لا يزال غير مفهومبشكلجيد1،2،3،4. وبالنظر إلى أن BM يحتوي على ~ 103−105 الكريات البيض / مل، يمكن تقدير أن الرضع الذين يرضعون رضاعة طبيعية تناول ~ 105−108 الكريات البيض الأم يوميا5. وقد أظهرت دراسات مختلفة في الجسم الحي أن الكريات البيض الأمومية توفر مناعة حرجة للطفل وتعمل بشكل جيد خارج هذه المواقع من الابتلاع الأولي5و6و7و8 ،9،10،11. جميع الخلايا المشتقة من الأمومة التي ابتلعها الرضيع لديها القدرة على أداء وظائف المناعة جنبا إلى جنب أو للتعويض عن الكريات البيض الخاصة بالرضيع12.
ولا يزال انتقال فيروس نقص المناعة البشرية من الأم إلى الطفل يشكل أزمة في البلدان المحدودة الموارد. وبما أن أمراض الإسهال والجهاز التنفسي مسؤولة عن معدلات كبيرة من الوفيات بين الرضع في البلدان المحدودة الموارد، وهذه الأمراض تنخفض بدرجة كبيرة عن طريق الرضاعة الطبيعية الخالصة، والفوائد التي تعود على الأمهات المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية من الرضاعة الطبيعية تفوق بكثير المخاطر13،14،15. وما لم يكن الحصول على المياه النظيفة وحليب الرضع المناسب موثوقاً به، فإن منظمة الصحة العالمية لا توصي بوقف الرضاعة الطبيعية للأمهات المصابات بفيروس نقص المناعة البشرية16. ويحدث سنوياً ما يقرب من 000 100 طن متري من الـ MTCT عن طريق BM؛ حتى الآن، فقط ~ 15٪ من الرضع الرضاعة الطبيعية من قبل أمهاتهم المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية تصبح مصابة، مما يشير إلى تأثير وقائي قوي من BM17،18،19،20،21. ومن المرجح أن تعمل عوامل عديدة جنبا إلى جنب لمنع انتقال العدوى. والأهم من ذلك أن الأجسام المضادة الخاصة بفيروس نقص المناعة البشرية (Abs) في BM قد ارتبطت بانخفاض انتقال العدوى من الأم إلى الطفل و/أو انخفاض وفيات الرضع بسبب الإصابة بفيروس نقصالمناعةالبشرية22و23. ما لا يزال غير واضح إلى حد كبير هو مساهمة الجزء الخلوي من BM لصفاته المضادة للفيروسات.
العديد من Abs تسهيل مجموعة متنوعة من الأنشطة المضادة للفيروسات بوساطة المنطقة ‘ثابتة’ من جزيء الغلوبولين المناعي، والجزء القابل للتبلور (Fc)، عن طريق التفاعل مع مستقبلات Fc (FcRs) وجدت على جميع الخلايا المناعية الفطرية تقريبا، وكلها تقريبا موجودة في الإنسان BM24. وقد ثبت أن الفيغوسياتوsات الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCP) ضرورية لإزالة العدوى الفيروسية، وقد تم دراسة ناقصة في حالة الوقاية من انتقال الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية25،26،27، 28 , 29.نظرا لندرة المعرفة حول المساهمة المحتملة لنشاط ADCP من قبل phagocytes BM للوقاية من انتقال انتقال الإصابة من الأم إلى الطفل من فيروس نقص المناعة البشرية، كنا نهدف إلى تطوير طريقة صارمة لعزل الخلايا من BM البشرية من أجل إجراء دراسة للADCP بوساطة الخلايا من BM التي تم الحصول عليها في مراحل مختلفة من الرضاعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وُصفت لأول مرة في عام 201130 تقنية قياس التدفق القائم على قياس السيتومترية لقياس نشاط ADCP الوارد وصفها هنا، وقد ثبت منذ ذلك الحين أنها قوية واستشهد بها في أكثر من 80 دراسة. البروتوكول الموصوف هنا يتكيف مع هذه التقنية للاستخدام مع خلايا BM الأولية للمرة الأولى. كانت الدراسات السا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتورة سوزان زوللا بازنر في قسم الطب وقسم الأحياء الدقيقة في كلية إيكان للطب في جبل سيناء على مراجعة المخطوطات. وقدمت المؤسسة الوطنية للصحة/المعهد الوطني للصحة/المعهد الوطني للصحة/المركز الوطني للصحة/المركز الوطني للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة/اللجنة الوطنية للصحة والقضاء على تنفيذ القدرات تمويلاً لهذا المشروع في إطار المنحة رقم R21 HD0 وبالإضافة إلى ذلك، تلقى ر. باول الدعم من أموال من قسم الطب، شعبة الأمراض المعدية، كلية إيكان للطب في جبل سيناء.
Materials
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
References
- Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
- Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).
- Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).
- Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).
- Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).
- Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).
- Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).
- Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).
- Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).
- Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
- Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer’s Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11 (6), e0156762 (2016).
- Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29 (2011).
- Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).
- Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).
- WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).
- World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. , (2016).
- Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
- Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).
- Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10 (12), e0145150 (2015).
- Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).
- Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143 (2012).
- Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).
- Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).
- Ackerman, M., Nimmerjahn, F. . Antibody Fc. , (2014).
- Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).
- Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).
- Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).
- Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
- Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).
- Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).
- Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).
- Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618 (2013).
- Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).
- Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10 (8), e0135580 (2015).
- Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).
- Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).
