Isolement des leucocytes du lait maternel humain pour une utilisation dans une essai de phagocytose cellulaire dépendante des anticorps des cibles de VIH
Summary
Le lait maternel transmet le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), bien que seulement 15 % des nourrissons allaités par des mères infectées par le VIH soient infectés. Les nourrissons allaités ingèrent 105à 108 leucocytes maternels par jour, bien que ces cellules soient sous-étudiées. Ici nous décrivons l’isolement des leucocytes de lait maternel et une analyse de leur capacité phagocytic.
Abstract
Même en l’absence de médicaments antirétroviraux, seulement 15 % des nourrissons allaités par des mères infectées par le VIH sont infectés, ce qui suggère un fort effet protecteur du lait maternel (BM). À moins que l’accès à de l’eau potable et à des préparations pour nourrissons appropriées ne soit fiable, l’OMS ne recommande pas l’arrêt de l’allaitement maternel pour les mères infectées par le VIH. De nombreux facteurs fonctionnent probablement en tandem pour réduire la transmission de La BM. Les nourrissons allaités ingèrent par jour 105à 108 leucocytes maternels, bien que ce qui reste largement incertain, c’est la contribution de ces cellules aux qualités antivirales de la BM. Actuellement, nous avons cherché à isoler les cellules de la BM humaine afin de mesurer phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP), l’une des réponses immunitaires innées les plus essentielles et les plus répandues, par les phagocytes BM contre les cibles du VIH. Des cellules ont été isolées de 5 échantillons humains de BM obtenus à divers stades de lactation. L’isolement a été effectué par centrifugation douce suivie d’une élimination soigneuse de la graisse de lait et le lavage répété de la pastille cellulaire. Les perles fluorescentes recouvertes d’épitope de l’enveloppe du VIH (Env) ont été utilisées comme cibles pour l’analyse du PCAA. Des cellules ont été souillées avec le marqueur de surface CD45 pour identifier des leucocytes. On a constaté que l’activité de l’ADCP était significative au-dessus des expériences de contrôle et reproductiblement mesurable à l’aide d’un anticorps spécifique au VIH 830A.
Introduction
Le lait maternel humain (BM) est composé de cellules maternelles qui sont viablesà 90% 1 . La composition cellulaire est fortement affectée par le stade de lactation, l’état de santé de la mère et du nourrisson, et la variation individuelle, qui reste mal comprise1,2,3,4. Étant donné que la BM contient 103à 105 leucocytes/mL, on peut estimer que les nourrissons allaités ingèrent 105à 108 leucocytes maternels par jour5. Diverses études in vivo ont démontré que les leucocytes maternels fournissent une immunité critique au nourrisson et sont fonctionnels bien au-delà de ces sites d’ingestion initiale5,6,7,7 ,9,10,11. Toutes les cellules d’origine maternelle ingérées par le nourrisson ont le potentiel d’effectuer des fonctions immunitaires à côté ou de compenser les leucocytes12.
La transmission mère-enfant (TMT) du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) reste une crise dans les pays à ressources limitées. Étant donné que les maladies diarrhéiques et respiratoires sont responsables de taux de mortalité importants chez les nourrissons dans les pays à ressources limitées, et que ces maladies sont considérablement réduites par l’allaitement exclusif, les avantages pour les mères infectées par le VIH l’allaitement maternel l’emporte de loin sur les risques13,14,15. À moins que l’accès à de l’eau potable et à des préparations pour nourrissons appropriées ne soit fiable, l’OMS ne recommande pas l’arrêt de l’allaitement maternel pour les mères infectées par le VIH16. Environ 100 000 MTT par l’intermédiaire de BM se produisent annuellement ; pourtant, seulement 15 % des nourrissons allaités par leur mère infectée par le VIH sont infectés, ce qui suggère un fort effet protecteur de la BM17,18,19,20,21. De nombreux facteurs fonctionnent probablement en tandem pour prévenir la transmission. Fait important, les anticorps spécifiques au VIH (Abs) dans le BM ont été corrélés avec une réduction du MTCT et/ou une réduction de la mortalité infantile par infection par le VIH22,23. Ce qui reste largement flou est la contribution de la fraction cellulaire de BM à ses qualités antivirales.
Beaucoup d’Abs facilitent une variété d’activités antivirales médiées par la région « constante » de la molécule d’immunoglobuline, le fragment cristallin (Fc), par l’intermédiaire de l’interaction avec des récepteurs de Fc (FcRs) trouvés sur pratiquement toutes les cellules immunitaires innées, pratiquement toutes qui se trouvent dans l’humain BM24. La phagocytose cellulaire dépendante des anticorps (ADCP) a été démontrée comme nécessaire pour le dégagement des infections virales et a été sous-étudiée dans le cas de la prévention du MTCT du VIH25,26,27, 28 Annonces , 29. Étant donné le manque de connaissances sur la contribution potentielle de l’activité ADCP par les phagocytes BM à la prévention du TMT du VIH, nous avons cherché à mettre au point une méthode rigoureuse pour isoler les cellules de la BM humaine afin d’entreprendre une étude de l’ADCP BM obtenu à divers stades de lactation.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique basée sur la cytométrie du débit pour mesurer l’activité ADCP décrite ci-dessus a été décrite pour la première fois en 201130 et a depuis fait ses preuves et a été citée dans plus de 80 études. Le protocole décrit ici adapte cette technique pour une utilisation avec des cellules BM primaires pour la première fois. Les études antérieures de la fonctionnalité fc-négociée par les cellules De MB ont été en grande partie limitées à la mesure des éclats oxydatifs ou…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions la Dre Susan Zolla-Pazner, du Département de médecine et de microbiologie de l’École de médecine Icahn du Mont Sinaï, pour son examen des manuscrits. Le NIH/NICHD a fourni du financement pour ce projet sous le numéro de subvention R21 HD095772-01A1. En outre, R. Powell a été soutenu par des fonds du Département de médecine, Division des maladies infectieuses, Icahn School of Medicine à Mount Sinai.
Materials
| 1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres | Thermo Fisher | F8776 | |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560975 | |
| Bovine serum Albumin | MP Biomedicals | 8810025 | |
| Corning V-bottom polystyrene 96-well plate | Corning | 3894 | |
| Cytochalasin D | Sigma | 22144-77-0 | |
| EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit | Thermo Fisher | 21338 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352196 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352070 | |
| Fixable Viability Stain 450 | BD | 562247 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | 252549 | |
| HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red | Life Technologies | 14175-095 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | |
| Human Serum Albumin | MP Biomedicals | 2191349 | |
| Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| PBS 1x pH 7.4 | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Polystyrene 10mL Serological Pipettes | Corning | 4488 | |
| Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL | Pierce | 88512 |
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