En ektopisk Chemokine uttrycks modell för att testa macrophage rekrytering in vivo
Summary
För att testa effekten av en Chemokine på makrofag rekrytering in vivo, var hela Mount in situ hybridisering används för att upptäcka ektopisk uttryck för Chemokine, och immunofärgning användes för att märka makrofager. Live Imaging användes för realtids observation av makrofagmigrering.
Abstract
Zebrafish används ofta i grundläggande och biomedicinsk forskning. Många zebrafiskar transgena linjer är för närvarande tillgängliga för att märka olika typer av celler. På grund av den genomskinliga embryonala kroppen av zebrafisk, det är bekvämt för oss att studera effekten av en Chemokine på beteendet hos en viss typ av celler in vivo. Här har vi tillhandahållit ett arbetsflöde för att undersöka funktionen hos en Chemokine på makrofagmigrering in vivo. Vi konstruerade en vävnad-specifika överuttryck plasmid att överuttrycka Il-34 och injiceras plasmiden i en cell skede transgena fisk embryon vars makrofager var särskilt märkta med ett fluorescerande protein. Vi använde sedan hela montera fluorescerande in situ hybridisering och immunofärgning att upptäcka mönstret av Chemokine uttryck och antalet eller lokalisering av makrofager. De injicerade WT-embryona höjdes för att generera en stabil transgen linje. Slutligen använde vi konfokalmikroskopi Live Imaging att direkt observera makrofag beteende i den stabila transgena fisken att studera funktionen av Il-34 på makrofager in vivo.
Introduction
Zebrafish är en liten tropisk hårda ben sötvattenfisk har sitt ursprung i Indien. Angående gen beskydd har zebrafiskar en likhet av 87% till människan1. Det kan ge oss insikter om relaterade ämnen av människan genom att studera genreglering, proteinfunktion och cell beteende såsom migration, proliferation et.al i zebrafisk. Zebrafish embryo kan användas för att observera utvecklingen av tidiga embryon i olika stadier efter att hämma pigment. Under tiden tar det bara tre månader för zebrafiskar att utvecklas till sexuell mognad, då zebrafisken kan producera hundratals ägg var 4 dagar. Mini-storlek, enkel avel, stark fortplantningsförmåga, dessa fördelar gör zebrafiskar kultur mycket utrymmesbesparande, bidrar till storskalig kultur. Den traditionella däggdjurs modellen mus har en högre underhållskostnader än Zebrafish, därför begränsa omfattningen av mus höjning. I aspekten av tidig embryonal utveckling, mus embryo är svårt att Observera i levande tillstånd på grund av egenskaperna hos mus embryots utveckling i moderlivmodern. Tvärtom, zebrafiskar embryon utvecklas externt och är transparenta, därför är de lätta att observera under ett mikroskop. Dessutom är zebrafiskar mycket lätt att konstruera en mängd transgena linjer för relaterad genfunktion forskning. För närvarande, olika zebrafiskar transgena linjer är tillgängliga för att märka olika typer av celler. Det är mycket bekvämt nu att konstruera transgena linjer för att överuttrycka chemokines på specifika platser och studera chemokines funktion på cell beteende i zebrafisk.
Här, vi tillhandahöll ett arbetsflöde för att använda zebrafiskar transgena linje för att undersöka funktionen av Il-34 på makrofage beteende in vivo2,3,4,5,6,7. För det första konstruerade vi en leverspecifik överuttryck plasmid av genen il34 och injiceras plasmiden i en-cells skede TG (MPEG1: GFP) fisk embryon som specifikt märkt makrofager av fluorescerande protein GFP. Sedan använde vi hela montera fluorescerande in situ hybridisering och immunofärgning att upptäcka mönstret av il34 uttrycket och antalet eller lokalisering av makrofager. De injicerade WT-embryona höjdes för att generera en stabil transgen linje. I dessa steg, vi etablerade och validerade cytokin-producerande linje och visuellt bedömas de effekter som kan ses på makrofagdistribution. Slutligen, för att undersöka makrofagbeteende som svar på cytokin, vi använde konfokalmikroskopi Live Imaging att direkt observera makrofagmigrering för att bekräfta funktionen av il34 på makrofagmigrering in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här tillåter oss att undersöka funktionen hos en Chemokine på beteendet hos macrophagein vivo och förfarandet kräver viss teknisk expertis. Sammanfattnings, det finns flera kritiska steg för att undvika komplikationer i protokollet: 1) Välj en lämplig transgena linje som visar specifika och starka transgena signalen att märka cellen av intresse; 2) Välj en lämplig vävnad som är tillgänglig för avbildning och transgena genöveruttryck. 3) gör en känslig och specifik RNA-sond; 4) …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Jingrong peng för att dela TG (fabp10a: DsRed) transgena linje; Dr. Zilong Wen för att dela TG (MPEG1: GFP) transgena linjer; Dr Koichi Kawakami för att tillhandahålla pTol2 Vector. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (31771594), Guangdong vetenskap och teknik plan projekt (2019A030317001) och de grundläggande forskningsfonderna för de centrala universiteten (D2191450).
Materials
| Antibody | |||
| Alexa 488-Anti-Goat antibody | Invitrogen | A11055 | |
| Anti-Digoxigenin-HRP | perkinelmer | NEF832001EA | |
| Goat-Anti-GFP antibody | Abcam | ab6658 | |
| Reagent | |||
| CaCl2· 2H2O | Sigma | 21097 | |
| Cyanine 3 Plus Amplification Reagent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| E2 solution | 15 mM NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM KH2PO4 + 50 µM Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 | ||
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Life | 10099-133 | |
| formamide | Diamond | A100314 | |
| glycerol | Sigma | V900860 | |
| heparin sodium | Sigma | H3149 | |
| hybridization buffer(HB) | 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/ml tRNA+ 0.1% Tween20 | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| low melting agarose | Sigma | A9414 | |
| methanol | GHTECH | 1.17112.023 | |
| methylene blue | Sigma | M9140 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| paraformaldehyde(PFA) | Sigma | 158127 | Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask. |
| 10×PBS | 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O | ||
| phenylthiourea(PTU) | Sigma | P7629 | |
| 1×Plus Amplification Diluent | perkinelmer | NEL745001KT | |
| Proteinase K | Fermentas | E00492 | |
| 20×Saline sodium citrate(SSC) | 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0 | ||
| sodium citrate | Sigma | A5040 | |
| tricaine | Sigma | E10521 | |
| tRNA | Sigma | R6625 | |
| Tween20 | Sigma | P2287 | |
| Plasmid | |||
| pBLK-fabp10a-il34-sv40 | For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation | ||
| pBSK-il34 | For il34 probe preparation | ||
| Fish | |||
| Tg (mpeg1: GFP) | Label macrophages with GFP | ||
| Tg (fabp10a: DsRed) | Label liver cells with DsRed | ||
| Tg (fab10a:il34) | Over-expression IL-34 in liver cells |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
- Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
- Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
- Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).
- Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
- Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
- Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: a practical approach. , (2002).
- Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).
