이 연구는 배아 줄기 세포에서 면역 자극 과립 대세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외약 농축 세포 소포를 분리하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
배아 줄기 세포 (ESC)는 모든 유형의 배아 세포로 자가 재생 및 분화를 할 수있는 만능 줄기 세포입니다. 다른 많은 세포 유형과 마찬가지로, ESC는 외식과 같은 작은 막 소포를 세포 외 환경에 방출합니다. 엑소좀은 세포간 통신의 필수 중재자 역할을 하며 많은 (patho) 생리적 과정에 기본적인 역할을 합니다. 과립구-대식세포 식민지 자극 인자(GM-CSF)는 면역 반응을 조절하기 위해 사이토카인으로서 기능한다. 엑소좀에 GM-CSF의 존재는 면역 조절 기능을 높일 가능성이 있다. 여기서, GM-CSF는 뮤린 ESC 세포주 ES-D3에서 안정적으로 과발현되었다. 프로토콜은 GM-CSF를 과발현하는 ES-D3 세포로부터 고품질 엑소좀 농축 세포 소포(EV)를 분리하기 위해 개발되었다. 고립 된 엑소좀 농축 된 전기는 다양한 실험적 접근법을 특징으로하였다. 중요한 것은, 상당한 양의 GM-CSF는 엑소좀 농축 된 전기 에 존재하는 것으로 나타났습니다. 전반적으로, ESC에서 GM-CSF 베어링 엑소좀 농축 된 전기 는 그들의 면역 규제 활동을 발휘 하기 위해 세포 없는 소포로 작동할 수 있습니다.
서론
ESC는 이식 전 배아1의배반성 단계에서 유래된다. 만능 줄기 세포로서, ESC는 배아 세포의 어떤 모형든지로 자기 갱신하고 분화할 수 있는 기능을 가지고 있습니다. 그들의 놀라운 발달 잠재력 및 장기 증식 능력으로 인해, ESC는 생물 의학 연구1에매우 귀중하다. 현재의 연구 노력은 주로 당뇨병, 심장 질환 및 신경 퇴행성 질환2,3,4를포함한 다양한 주요 병리학 적 질환에 대한 EsC의 치료잠재력에초점을 맞추고 있다.
ESC를 포함한 포유류 세포는 세포간 환경에 가변 크기로 소포를 방출하는 것으로 알려져 있으며, 이들 EV는 세포간 통신5에서의역할로 인해 많은 생리적 및 병리학적 기능을 갖는다. 이외 용이성 중에서도, 외형은 플라즈마 멤브레인6을가진 중간 내구, 다중 혈관 체납체(MVBs)의 융합시 세포외 공간으로 다양한 세포 유형에서 방출되는 작은 막 소포이다. 엑소좀은 세포간 통신을 중재하기 위해 보고....
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프로토콜
1. ES-D3 세포 배양
- 외성 없는 태아 소 혈청(FBS)을 생성하려면 FBS를 4°C에서 16시간 동안 100,000 x g의 초원심분리기 및 원심분리기로 로드합니다. 원심분리에 따라, 뮤린 ESC 세포주 ES-D3를 배양하고 엑소좀 농축 된 전기를 획득하기 위한 외성 없는 FBS로서 혈청 상피물을 수집합니다.
- ES-D3 세포를 도금하기 전에 실온에서 젤라틴(0.1%)을 사용하여 15cm 조직 배양 접시를 30분 동안 코팅합니다.
- 이전에 설명된프로토콜(16)에이어, 젤라틴 코팅 15cm 조직 배양식에서 피더 층 세포없이 ES-D3 세포를 배양한다. ES-D3 세포 배양 배지는 DMEM으로 구성되며, 엑소좀 없는 FBS(15%), 비필수 아미노산(0.1mM), L-글루타민(2mM), β-메르카토에탄올(0.1mMM), 페니실린(50단위/mL), 연쇄상구(50μg/mL), 백혈병 억제제 인자(LIF; 10000mL) 배양 ES-D3 세포는 37°C에서 5%CO2 가습인 인큐베이터에서.
- ES-D3 세포가 15cm 조직 배양 접시에 약 90%의 합류에 도달하면 포부로 배지를 제거합니다. 트립신 (5 mL; 0.05 %)을 사용하여 세포를 세척합니다....
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결과
GM-CSF는 뮤린 ESC에서 과발현된다.
ES-D3 세포에서 GM-CSF를 안정적으로 과발적으로 표현하기 위해, 뮤린 GM-CSF cDNA는 발현 벡터 pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP(도1A)를생성하는 형질 벡터로 복제되었다. GM-CSF는 ES-D3 세포에서 과발현되었고, 과도적으로 과도하게 감염된 ES-D3 세포의 약 20%가 GFP 양성이었다. 세포 클론은 GM-CSF 또는 빈 벡터 제어를 안정적으로 과발현하는 FACS에 의해 획득되었다. 도 1B에도시된 바와 같이, GM-CSF-발현 ES-D3 세포주 또는 빈 벡터를 발현하는 ES-D3 세포주의 GFP 형광 강도는 부모의 세포보다 훨씬 높았다. ELISA 분석은 상이한 세포주의 세포배양상수에서 GM-.......
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토론
이 연구는 면역 자극성 단백질 GM-CSF를 운반하는 외성 농축 된 전기를 생산하는 매우 효율적인 방법을 보여줍니다, 이는 외식 농축 된 EV의 면역 변조 효과를 연구하기 위해 사용할 수 있습니다. 몇몇 연구 결과는 엑소좀이 면역 조절 및 항종양 기능을 전시한다는 것을 건의합니다22. 따라서, GM-CSF를 표현하는 ESCs에서 엑소솜은 또한 면역 반응을 통제하는 생물학 활동을 소유할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 외인성 뮤린 GM-CSF는 형질전환에 의한 뮤린 ES-D3 세포에서 안정적으로 과발현되었다(도1). 중요하게도, GM-CSF의 상당량은 GM-CSF(도5)를과발현하는 ES-D3 세포로부터 분리된 엑소좀 농축 전기자동차에서 검출되었다.
이러한 데이터는 거의 모든 GM-CSF가 외민 농축 된 전기 자동차 내에 있음을 시사합.......
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공개 사항
카비타 야다나푸디, 치 리, 존 W. 이튼은 미국 특허 출원을 제출 "엔지니어링 배아 줄기 세포 유래 엑소좀과 그 사용 방법을 포함하는 조성물."
감사의 글
우리는 전송 전자 현미경 이미지를 획득하기 위한 Arkadiusz Slusarczyk 및 켄터키 생물 의학 연구 인프라 네트워크 (KBRIN, P20GM103436)에 감사드립니다. 이 작품은 NIH AA018016-01 (J.W.E.), 켄터키 연구 챌린지 트러스트 펀드 (J.W.E.), NIH CA106599 및 CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.), 무료 호흡 연구 (K.Y.)의 보조금에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
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재료
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| 안티 사이토크롬 c mAb | 산타 크루즈 생명공학 | 클론 A-8, sc-13156 | 웨스턴 블롯, RRID:AB_627385 |
| 안티-플로틸린-1 mAb | 산타크루즈 바이오테크 | 클론 C-2; sc-74566 | 웨스턴 블롯, RRID:AB_2106563 |
| 안티-GAPDH pAb | Rockland | 600-401-A33S | 웨스턴 블롯, RRID:AB_11182910 |
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참고문헌
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Resea....
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