Ein Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Modell mit Split Corneal Buttons
Summary
Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Herstellung und Kultivierung von Schweinespaltenhornknöpfen vorgestellt. Da dieses organotypisch kultivierte Organkulturmodell innerhalb von 15 Tagen Zellsterblichkeitsraten zeigt, vergleichbar mit menschlichen Spenderhornhäuten, stellt es das erste Modell dar, das eine langfristige Kultivierung nichtmenschlicher Hornhäuten ohne Zugabe von giftigem Dextran ermöglicht.
Abstract
Experimentelle Forschung an hornhauten Endothelzellen ist mit mehreren Schwierigkeiten verbunden. Menschliche Spenderhornhäuten sind knapp und selten für experimentelle Untersuchungen verfügbar, da sie normalerweise für eine Transplantation benötigt werden. Endothelzellkulturen übersetzen sich oft nicht gut in In-vivo-Situationen. Aufgrund der biostrukturellen Eigenschaften nichtmenschlicher Hornhäuten führt eine stromale Schwellung während der Kultivierung zu einem erheblichen Korneal-Endothelzellverlust, der die Kultivierung über einen längeren Zeitraum erschwert. Entschwellende Mittel wie Dextran werden verwendet, um dieser Reaktion entgegenzuwirken. Jedoch, Sie verursachen auch signifikanteen Endothelzellverlust. Daher wurde ein Ex-vivo-Organkulturmodell ohne Entschwellende Mittel etabliert. Schweineaugen aus einem örtlichen Schlachthof wurden verwendet, um gespaltene Hornhautknöpfe zuzubereiten. Nach partieller Hornhauttrephination wurden die äußeren Schichten der Hornhaut (Epithel, Bogenmannschicht, Teile der Stroma) entfernt. Dies reduziert signifikant den verlustfreien Hornhautzellverlust, der durch massive stromale Schwellungen und Descemets Membranfaltung über längere Kultivierungsperioden verursacht wird, und verbessert die allgemeine Erhaltung der Endothelzellschicht. Auf die anschließende vollständige Hornhauttrephination folgte die Entfernung des gespaltenen Hornhautknopfes aus der verbleibenden Augenzwiebel und der Kultivierung. Die Endothelzelldichte wurde in Folgezeiten von bis zu 15 Tagen nach der Zubereitung (d. h. tage 1, 8, 15) mittels Lichtmikroskopie bewertet. Die verwendete Zubereitungstechnik ermöglicht eine bessere Konservierung der Endothelzellschicht, die durch eine geringere stromale Gewebeschwellung ermöglicht wird, was zu langsamen und linearen Abnahmeraten in gespaltenen Hornhautknöpfen führt, die mit menschlichen Spenderhornhäuten vergleichbar sind. Da dieses standardisierte organotypisch kultivierte Forschungsmodell erstmals einen stabilen Anbau für mindestens zwei Wochen ermöglicht, ist es eine wertvolle Alternative zu menschlichen Spenderhornhäuten für zukünftige Untersuchungen verschiedener externer Faktoren in Bezug auf ihre Wirkungen auf das Hornhautendothel.
Introduction
Hornhauttransplantationsverfahren gehören zu den am häufigsten durchgeführten Transplantationen weltweit1. Da es einen schweren Mangel an menschlichen Spender Hornhäuten gibt, ist experimentelle Forschung zur Bekämpfung von Hornhautendothelzellen in menschlichen Hornhäuten schwierig,1durchzuführen. Die Einführung von Bewässerungslösungen und anderen im Auge verwendeten Substanzen, ophthalmologischen viskoelastischen Geräten sowie chirurgischen Instrumenten und Techniken (z. B. Phakoemulsifikationsinstrumente und -techniken, Ultraschallenergie) valide und umfangreiche Untersuchungen über ihre Auswirkungen auf das Hornhautendothel vor der klinischen Anwendung.
Für die Forschung gibt es nur wenige Alternativen zu menschlichen Spenderhornhäuten. Tierforschungsmodelle sind sehr wertvoll, aber gleichzeitig sehr ressourcenverbrauchend und zunehmend ethisch hinterfragt. Ein großer Nachteil der In-vitro-Zellkulturen ist ihre begrenzte Übersetzung in das menschliche Auge. Die Ergebnisse aus Zellkulturen können unpassend zu In-vivo-Bedingungen sein, da Zellen einen endotheliaalen mesenchymalen Übergang (EMT) durchlaufen können, was zu einer fibroblastenähnlichen Morphologie führt, die durch den Verlust der Zellpolarität und Veränderungen der Zellform und des Gens verursacht wird. Ausdruck2.
Während frühere Ex-vivo-Modelle Anbauzeiten von bis zu 120 h meldeten, wurde vor kurzem eine neuartige Zubereitungstechnik eingeführt, um ein Porenhorn-Endothel-Organkulturmodell zu etablieren, indem frische Schweinehornhäasen für mindestens 15 Tage kultiviert wurden3 ,4,5,6. Wenn das Hornhautepithel und Teile des Stroma vor der Kultivierung aus der Hornhaut entfernt werden (insgesamt ca. 300 m), wird die Schwellung des Stroma in gespaltenen Hornhautknöpfen reduziert, was zu einem geringeren Endothelzellverlust und einem gepflegten Endothel Zellschicht nach bis zu 15 Tagen, während nicht-gespaltene Hornhautknöpfe einen signifikanten Endothelzellverlust aufgrund ungleichmäßiger stromaler Schwellungen und der Bildung von Descemets Falten aufweisen. Augenbänke verwenden in der Regel osmotische Entschwellende Mittel wie Dextran, um die Schwellung von Hornhäuten vor der Transplantation zu reduzieren. Jedoch, Diese Agenten wurden gezeigt, dass erhöhte Endothelzellverlust7,8,9induzieren.
Dieser Artikel zielt darauf ab, dieses standardisierte Ex-vivo-Forschungsmodell in einem detaillierten Schritt-für-Schritt-Protokoll zu visualisieren, um zukünftigen Forschern die Durchführung von Forschungen am Hornhautendothel mit gespaltenen Hornhautknöpfen zu ermöglichen. Dieses Modell stellt eine einfache Methode dar, um Substanzen und Techniken zu testen, die im Auge verwendet werden, wie ophthalmologische viskoelastische Geräte, Bewässerungslösungen und Ultraschallenergie oder andere Verfahren, bei denen das Hornhautendothel von Interesse ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Herstellung von Schweinesplit-Hornhautknöpfen, die ein standardisiertes und kostengünstiges ex vivo korneales endotheliales Organkulturmodell für Forschungszwecke darstellt6. Porcin Split Hornhautknöpfe zeigten eine Abnahme der Endothelzelldichte vergleichbar mit Endothelzellverlusten, die in menschlichen Spenderhornhäuten beobachtet wurden, die in Augenbänken über einen Zeitraum von zwei Wochen kultiviert wurden6,<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Erstellung des vorgestellten Forschungsmodells wurde von KMU-innovativ (FKZ: 13GW0037F) des Bundesministeriums für Bildung und Forschung Deutschland unterstützt.
Materials
| Subject | |||
| Pig eyes | local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Fetal calf serum | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Hydrochloric acid (HCl) solution | own production | ||
| Hypotonic balanced salt solution | own production | per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g | |
| Povidon iodine 7.5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium chloride (NaCl) 0.9% | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | own production | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materials & Instruments | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Germany | ||
| Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germany | ||
| Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Cell culture plate (12 well) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
| Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
| Eye scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Folded Filter ø 185 mm | Whatman, USA | ||
| Hockey knife | Geuder AG, Germany | ||
| Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL | Schott AG, Germany | ||
| Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany | ||
| MillexGV Filter (5 µm) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Needler holder | Geuder AG, Germany | ||
| Petri dishes | VWR International, USA | ||
| Pipette tips | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Scalpel (single use), triangular blade | Aesculap AG & Co. KG, Germany | ||
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Serological pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Sterile cups | Greiner Bio-One, Österreich | ||
| Sterile gloves | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Sterile surgical drape | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Stitch scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Syringe (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| trephine ø 7.5 mm | own production | ||
| Tying forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Weighing paper | neoLab Migge GmbH, Germany | ||
| Equipment & Software | |||
| Binocular surgical microscope | Carl Zeiss AG, Germany | ||
| Camera mounted on microscope | Olympus, Japan | ||
| CellSens Entry (software) | Olympus, Japan | ||
| Cold-light source | Schott AG, Germany | ||
| Incubator | Heraeus GmbH, Germany | ||
| Inverted phase contrast microscope | Olympus GmbH, Germany | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany | ||
| pH-meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Precision scale | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |
References
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