En svin hornhinnen endothelial organ kultur modell ved hjelp av Split hornhinne knapper

Summary

Her presenteres en steg-for-trinn-protokoll for utarbeidelse og dyrking av svin delt hornhinne knapper. Ettersom denne organo-typisk dyrket orgel kultur modellen viser cellen dødstallene innen 15 dager, kan sammenlignes med menneskelig donor hornhinner, representerer den første modellen gir langsiktig dyrking av ikke-menneskelige hornhinner uten å legge giftig dextran.

Abstract

Eksperimentell forskning på hornhinnen endothelial celler er forbundet med flere vanskeligheter. Human donor hornhinner er knappe og sjelden tilgjengelig for eksperimentelle undersøkelser som de er normalt nødvendig for transplantasjon. Endothelial cellekulturer ofte ikke oversette godt til in vivo situasjoner. På grunn av biostructural karakteristikker av ikke-menneskelige hornhinner, stromal hevelse under dyrking induserer betydelig hornhinne endothelial celle tap, noe som gjør det vanskelig å utføre dyrking i en lengre periode. Deswelling midler som dextran brukes til å motvirke dette svaret. Men de også forårsake betydelig endothelial celle tap. Derfor ble en ex vivo organ kultur modell som ikke krevde deswelling agenter etablert. Pig øyne fra en lokal slakteri ble brukt til å forberede delt hornhinnen knapper. Etter delvis hornhinne inngrep, de ytre lag av hornhinnen (epitel, Bowman lag, deler av stroma) ble fjernet. Dette reduserer hornhinnen endothelial celle tap indusert av massiv stromal hevelse og Descemefs ‘ s membran folding gjennom lengre dyrking perioder og forbedrer generell bevaring av endothelial celle laget. Påfølgende komplett hornhinne inngrep ble etterfulgt av fjerning av splitt hornhinnen knappen fra de resterende øye pære og dyrking. Endothelial celle tetthet ble vurdert ved oppfølgings tider på opptil 15 dager etter tilberedning (dvs. dager 1, 8, 15) ved hjelp av lys mikroskopi. Preparatet teknikken brukes gir en bedre bevaring av endothelial celle laget aktiveres av mindre stromal vev hevelse, som resulterer i langsom og lineær nedgang priser i delt hornhinnen knapper sammenlignes med menneskelig donor hornhinner. Som denne standardiserte organo-vanligvis dyrket forsknings modell for første gang gir en stabil dyrking i minst to uker, er det et verdifullt alternativ til menneskelig donor hornhinner for fremtidige undersøkelser av ulike eksterne faktorer med hensyn til deres effekter på hornhinnen endotelet.

Introduction

Hornhinnen transplantasjon prosedyrer er blant de hyppigst utførte Sygehus over hele verden¹. Ettersom det er en alvorlig mangel på menneskelig donor hornhinner, eksperimentell forskning adressering hornhinnen endothelial celler i menneskelig hornhinner er vanskelig å utføre¹. Men innføringen av vannings løsninger og andre stoffer som brukes i øyet, viskoelastiske enheter, samt Kirurgiske instrumenter og teknikker (f. eks, phacoemulsification instrumenter og teknikker, ultralyd energi) krever gyldige og omfattende undersøkelser om deres virkninger på hornhinnen endotelet før klinisk bruk.

Få alternativer til menneskelige donor hornhinner eksisterer for forskning. Animal forskning modeller er svært verdifull, men på samme tid svært ressurskrevende og stadig spørsmålstegn etisk. En stor ulempe for in vitro cellekulturer er deres begrenset oversettelse til det menneskelige øyet. Resultater innhentet fra cellekulturer kan være urimelig å i vivo forhold, fordi cellene kan gjennomgå endothelial mesenchymal overgang (EMT), noe som resulterer i Fibroblast-lignende morfologi forårsaket av tap av celle polaritet og endringer i celle form og gen uttrykket².

Mens tidligere ex vivo-modeller rapporterte dyrking perioder på opp til bare 120 h, en roman forberedelse teknikk for å etablere en svin hornhinnen endothelial orgel kultur modell av dyrking fersk gris hornhinner i minst 15 dager ble nylig innført^{3 ,4,5,6}. Hvis hornhinnen epitel og deler av stroma er fjernet (ca 300 μm totalt) fra hornhinnen før dyrking, hevelse i stroma er redusert i delt hornhinnen knapper resulterer i mindre endothelial celle tap og en godt vedlikeholdt endothelial celle lag etter opp til 15 dager, mens ikke-delt hornhinnen knapper viser signifikant endothelial celle tap på grunn av ujevn stromal hevelse og dannelse av Descemefs ‘ s folder. Øye bankene bruker vanligvis osmotisk deswelling midler som dextran for å redusere hevelse av hornhinner før transplantasjon. Imidlertid ble disse agentene vist å indusere økt endothelial celle tap^7,8,9.

Denne artikkelen tar sikte på å visualisere denne standardiserte ex vivo forskning modell i en detaljert trinn-for-trinn-protokollen for å muliggjøre fremtidige etterforskere til å utføre forskning på hornhinnen endotelet ved hjelp av delt hornhinnen knapper. Denne modellen representerer en grei metode for å teste stoffer og teknikker som brukes i øyet, for eksempel viskoelastiske enheter, vannings løsninger og ultralydsenergi, eller andre prosedyrer der hornhinnen endotelet er av interesse.

Protocol

Denne protokollen følger de etiske retningslinjene for institusjonen vår. I samsvar med vedtektene for vår institusjon etiske vurdering komiteen ingen etisk godkjenning måtte innhentes før eksperimentene, som alle svin hornhinner ble innhentet fra den lokale slakteri. 1. orgel kultur Forbered gris øyne. Fra den lokale slakteri, få gris øyne som ble fjernet kort tid postmortem men før termisk behandling. Transporter øynene til laboratoriet og behandle dem i løpet av…

Representative Results

Den presenterte disseksjon teknikken innebærer delvis fjerning av stromal vev, noe som resulterer i en tynnere hornhinne prøve og dermed mindre stromal hevelse (figur 1 og figur 2). Mindre stromal hevelse induserer mindre skjær og klype krefter som har en negativ innvirkning på hornhinnen endotelet, og dermed forårsaker lavere endothelial celle tap priser6. Split hornhinnen knapper viser en betydelig …

Discussion

Denne protokollen gir en metode for utarbeidelse av svin delt hornhinnen knapper, som representerer en standardisert og rimelig ex vivo hornhinnen endothelial organ kultur modell for forskningsformål⁶. Svin Split hornhinne knappene viste en reduksjon av endothelial celle tetthet sammenlignes med endothelial celle tap observert i Human donor hornhinner dyrket i øye bankene over en to-ukers periode^6,10,11…

Materials

Subject
Pig eyes	local abbatoir
Substances
Alizarin red S	Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016	Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x)	Gibco, USA
Fetal calf serum	Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution	own production
Hypotonic balanced salt solution	own production		per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9%	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution	own production
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro	Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL	Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G	Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well)	Corning Inc., USA
Colibri forceps	Geuder AG, Germany
Corneal scissors	Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette	Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder	L. Klein, Germany
Eye scissors	Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm	Whatman, USA
Hockey knife	Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL	Schott AG, Germany
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm)	Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder	Geuder AG, Germany
Petri dishes	VWR International, USA
Pipette tips	Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade	Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups	Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves	Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape	Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors	Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6	Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL)	Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm	own production
Tying forceps	Geuder AG, Germany
Weighing paper	neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope	Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope	Olympus, Japan
CellSens Entry (software)	Olympus, Japan
Cold-light source	Schott AG, Germany
Incubator	Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope	Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal	VWR International, USA
Photoshop CS2	Adobe Systems, USA
Precision scale	Ohaus Europe GmbH, Switzerland