Un modello di cultura dell'organo endoteliale porcina utilizzando i pulsanti corneali divisi

Summary

Qui, viene presentato un protocollo passo-passo per la preparazione e la coltivazione di bottoni corneali divisi su porcini. Poiché questo modello di coltura organo-tipicamente coltivata mostra i tassi di mortalità cellulare entro 15 giorni, paragonabili alle cornee dei donatori umani, rappresenta il primo modello che consente la coltivazione a lungo termine di cornee non umane senza aggiungere dextran tossico.

Abstract

La ricerca sperimentale sulle cellule endoteliali corneali è associata a diverse difficoltà. Le cornee dei donatori umani sono scarse e raramente disponibili per le indagini sperimentali, in quanto sono normalmente necessarie per il trapianto. Le colture di cellule endoteliali spesso non si traducono bene in situazioni in vivo. A causa delle caratteristiche biostrutturali delle cornee non umane, il gonfiore stromale durante la coltivazione induce una sostanziale perdita di cellule endoteliali corneali, che rende difficile eseguire la coltivazione per un lungo periodo di tempo. Gli agenti di deswelling come dextran vengono utilizzati per contrastare questa risposta. Tuttavia, causano anche una significativa perdita di cellule endoteliali. Pertanto, è stato istituito un modello di coltura di organi ex vivo che non richiede agenti di deswelling. Occhi di maiale da un macello locale sono stati utilizzati per preparare i pulsanti corneali divisi. Dopo una parziale trefinazione corneale, gli strati esterni della cornea (epitelio, strato di arco, parti dello stroma) sono stati rimossi. Questo riduce significativamente la perdita di cellule endoteliali indotte da un massiccio gonfiore stromale e dal ripiegamento della membrana di Descemet durante i periodi di coltivazione più lunghi e migliora la conservazione generale dello strato di cellule endoteliali. La successiva trefinazione corneale completa fu seguita dalla rimozione del pulsante corneale diviso dal bulbo oculare rimanente e dalla coltivazione. La densità delle cellule endoteliali è stata valutata nei periodi di follow-up fino a 15 giorni dopo la preparazione (cioè i giorni 1, 8, 15) utilizzando la microscopia leggera. La tecnica di preparazione utilizzata consente una migliore conservazione dello strato di cellule endoteliali, resa possibile da un rallentamento del tessuto stromale, che si traduce in tassi di declino lenti e lineari nei bottoni corneali divisi paragonabili alle cornee dei donatori umani. Poiché questo modello di ricerca standardizzato coltivato organo-tipicamente consente per la prima volta una coltivazione stabile per almeno due settimane, è una valida alternativa alle cornee dei donatori umani per future indagini su vari fattori esterni effetti sull’endotelio corneale.

Introduction

Le procedure di trapianto di cornea sono tra le trapianti più comunemente eseguite in tutto il mondo¹. Poiché vi è una grave carenza di cornee dei donatori umani, la ricerca sperimentale che si occupa delle cellule endoteliali corneali nelle cornee umane è difficile da eseguire¹. Tuttavia, l’introduzione di soluzioni di irrigazione e altre sostanze utilizzate all’interno dell’occhio, dispositivi viscolicici oftalmici, così come strumenti e tecniche chirurgiche (ad esempio, strumenti e tecniche di facoemulsificazione, energia ecografica) richiede valide ed estese indagini riguardanti i loro effetti sull’endotelio corneo prima dell’uso clinico.

Esistono poche alternative alle cornee dei donatori umani per la ricerca. I modelli di ricerca sugli animali sono molto preziosi, ma allo stesso tempo molto dispendiosi in termini di risorse e sempre più in discussione eticamente. Uno dei principali inconvenienti delle colture di cellule in vitro è la loro limitata traduzione all’occhio umano. I risultati ottenuti dalle colture cellulari possono essere incongrui in condizioni in vivo, perché le cellule possono subire una transizione mesenchymica endoteliale (EMT), con conseguente morfologia fibroblasta-come causata dalla perdita di polarità cellulare e cambiamenti nella forma cellulare e gene l’espressione².

Mentre i precedenti modelli ex vivo riportavano periodi di coltivazione fino a 120 h, è stata recentemente^{introdotta una nuova tecnica di preparazione per stabilire un modello di coltura endoteliale endoteliale del porcellino, coltiva cornee di maiale fresco per almeno 15 giorni ,4,5,6}. Se l’epitelio corneale e parti dello stroma vengono rimossi (circa 300 m in totale) dalla cornea prima della coltivazione, il gonfiore dello stroma viene ridotto in pulsanti corneali divisi con conseguente perdita di cellule meno endoteliali e un endoteliale ben mantenuto strato mastrose dopo fino a 15 giorni, mentre i pulsanti corneali non divisi mostrano una significativa perdita di cellule endoteliali a causa di gonfiore stromale irregolare irregolare e formazione delle pieghe di Descemet. I banchi oculari di solito usano agenti di deswelling osmotici come dextran per ridurre il gonfiore delle cornee prima del trapianto. Tuttavia, questi agenti hanno dimostrato di indurre una maggiore perdita di cellule endoteliali^7,8,9.

Questo articolo ha lo scopo di visualizzare questo modello di ricerca ex vivo standardizzato in un protocollo dettagliato passo-passo al fine di consentire ai futuri ricercatori di eseguire ricerche sull’endotelio cornealeutilizzando utilizzando pulsanti corneali divisi. Questo modello rappresenta un metodo semplice per testare le sostanze e le tecniche utilizzate all’interno dell’occhio, come i dispositivi viscolicici oftalmici, le soluzioni di irrigazione e l’energia ad ultrasuoni o altre procedure in cui l’endotelio corneale è di interesse.

Protocol

Questo protocollo segue gli orientamenti etici della nostra istituzione. Conformemente agli statuti del comitato di revisione etica del nostro istituto non è stato necessario ottenere alcuna approvazione etica prima degli esperimenti, poiché tutte le cornee di suine sono state ottenute dal macello locale. 1. Cultura dell’organo Preparare gli occhi di maiale. Dal macello locale, ottenere gli occhi di maiale che sono stati rimossi poco dopo la morte ma prima del trattamento t…

Representative Results

La tecnica di dissezione presentata implica la rimozione parziale del tessuto stromale, con conseguente un campione di cornea più sottile e quindi un gonfiore meno stromale (Figura 1 e Figura 2). Il gonfiore meno stromale induce meno forze di taglio e pizzico che hanno un impatto negativo sull’endotelio corneale, causando così una minore perdita di cellule endoteliali6. I pulsanti corneali divisi mostran…

Discussion

Questo protocollo fornisce un metodo per la preparazione di pulsanti corneali divisi su vitello, che rappresenta un modello standardizzato e a basso costo di coltura endoteliale endoteliale per scopi di ricerca⁶. I bottoni corneali porcini divisi hanno mostrato una diminuzione della densità delle cellule endoteliali paragonabile alle perdite di cellule endoteliali osservate nelle cornee dei donatori umani coltivate nelle banche oculari per un periodo di due settimane^6…

Materials

Subject
Pig eyes	local abbatoir
Substances
Alizarin red S	Sigma-Aldrich, USA
Culture Medium 1, #F9016	Biochrom GmbH, Germany
Dulbecco's PBS (1x)	Gibco, USA
Fetal calf serum	Biochrom GmbH, Germany
Hydrochloric acid (HCl) solution	own production
Hypotonic balanced salt solution	own production		per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g
Povidon iodine 7.5%, Braunol	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium chloride (NaCl) 0.9%	B. Braun Melsungen AG, Germany
Sodium hydroxide (NaOH) solution	own production
Trypan blue 0.4%	Sigma-Aldrich, USA
Materials & Instruments
Accu-jet pro	Brand GmbH, Germany
Beaker Glass 50 mL	Schott AG, Germany
Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G	Becton Dickinson, USA
Cell culture plate (12 well)	Corning Inc., USA
Colibri forceps	Geuder AG, Germany
Corneal scissors	Geuder AG, Germany
Eppendorf pipette	Eppendorf AG, Germany
Eye Bulb Holder	L. Klein, Germany
Eye scissors	Geuder AG, Germany
Folded Filter ø 185 mm	Whatman, USA
Hockey knife	Geuder AG, Germany
Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL	Schott AG, Germany
Magnetic stir bar	Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany
MillexGV Filter (5 µm)	Merck Millopore Ltd., USA
Needler holder	Geuder AG, Germany
Petri dishes	VWR International, USA
Pipette tips	Sarstedt AG & Co., Germany
Scalpel (single use), triangular blade	Aesculap AG & Co. KG, Germany
Serological pipette 10 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Serological pipette 5 mL	Sarstedt AG & Co., Germany
Sterile cups	Greiner Bio-One, Österreich
Sterile gloves	Paul Hartmann AG, Germany
Sterile surgical drape	Paul Hartmann AG, Germany
Stitch scissors	Geuder AG, Germany
Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6	Ethicon Inc., USA
Syringe (5 mL)	Becton Dickinson, USA
trephine ø 7.5 mm	own production
Tying forceps	Geuder AG, Germany
Weighing paper	neoLab Migge GmbH, Germany
Equipment & Software
Binocular surgical microscope	Carl Zeiss AG, Germany
Camera mounted on microscope	Olympus, Japan
CellSens Entry (software)	Olympus, Japan
Cold-light source	Schott AG, Germany
Incubator	Heraeus GmbH, Germany
Inverted phase contrast microscope	Olympus GmbH, Germany
Magnetic stirrer with heating function	IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany
pH-meter pHenomenal	VWR International, USA
Photoshop CS2	Adobe Systems, USA
Precision scale	Ohaus Europe GmbH, Switzerland