Génération de gradients de médicaments hétérogènes à travers les populations cancéreuses sur un accélérateur d'évolution microfluidique pour l'observation en temps réel
Summary
Nous présentons un modèle microfluidique de cancer sur puce, la technologie « Accélérateur d’évolution », qui fournit une plate-forme contrôlable pour des études quantitatives à long terme en temps réel de la dynamique du cancer dans des conditions environnementales bien définies à une cellule unique niveau. Cette technologie devrait servir de modèle in vitro pour la recherche fondamentale ou le développement de médicaments précliniques.
Abstract
La culture cellulaire conventionnelle demeure le modèle préclinique le plus fréquemment utilisé, malgré sa capacité limitée prouvée de prédire les résultats cliniques dans le cancer. Des modèles microfluidiques de cancer sur puce ont été proposés pour combler le fossé entre les cultures 2D conventionnelles trop simplifiées et les modèles animaux plus compliqués, qui ont une capacité limitée de produire des résultats quantitatifs fiables et reproductibles. Ici, nous présentons un modèle microfluidique de cancer-sur-puce qui reproduit des composants clés d’un microenvironnement complexe de tumeur d’une manière complète, mais est assez simple pour fournir des descriptions quantitatives robustes de la dynamique de cancer. Ce modèle microfluidique de cancer-sur-puce, le « accélérateur d’évolution, » décompose une grande population de cellules cancéreuses dans un éventail interconnecté de microenvironnements de tumeur tout en générant un paysage hétérogène de stress chimiothérapeutique. La progression et la dynamique évolutive du cancer en réponse au gradient de drogue peuvent être surveillées pendant des semaines en temps réel, et de nombreuses expériences en aval peuvent être effectuées complémentaires aux images en time-lapse prises au cours des expériences.
Introduction
Le cancer est de plus en plus reconnu comme un écosystème complexe qui dépend non seulement de la dysrégulation continue des populations de cellules mutées, mais aussi des interactions vitales entre les cellules cancéreuses et le microenvironnement hôte. En ce sens, le cancer évolue sur un paysage adaptatif qui se manifeste par une combinaison de facteurs, y compris un microenvironnement tumoral hétérogène et un crosstalk avec une variété de cellules hôtes, qui contribuent toutes à des pressions sélectives pour d’autres changements épigénétiques1,2,3. Dans le contexte des tumeurs solides, la distribution inégale des produits chimiothérapeutiques et d’autres gradients de ressources contribue à leur hétérogénéité moléculaire et peut jouer un rôle dans le développement de la résistance aux médicaments, augmentation de l’angiogenèse à une tumeur particulière sous-populations, et même métastasis4,5,6. Les études conventionnelles de culture cellulaire 2D in vitro, tout en possédant une capacité expérimentale pratique à grande échelle, fournissent des conditions de champ moyen, uniformes et fixes, souvent dépourvues du contrôle environnemental spatial et temporel précis nécessaire pour imiter la dynamique tumorale in vivo. Ainsi, il est nécessaire de modèles ex vivo plus représentatifs pour reproduire le microenvironnement tumoral avant les modèles animaux dans le pipeline de développement de médicaments afin d’une meilleure prédiction de la progression du cancer ainsi que des réponses aux médicaments dans le stress dynamique Paysages. Des microfluidiques ont été proposés pour combler l’écart entre les études de culture cellulaire 2D et les études animales in vivo plus complexes qui pourraient ne pas être en mesure de soutenir les études quantitatives contrôlables7,8,9.
Un système in vitro idéal pour caractériser la dynamique des cellules cancéreuses devrait posséder la capacité de générer un microenvironnement hétérogène pour imiter les réponses cellulaires adaptatives qui peuvent avoir lieu dans une tumeur, ainsi que permettre l’observation de ces dynamiques à un résolution unicellulaire. Dans cet article, nous décrivons une plate-forme de culture cellulaire microfluidique, un dispositif basé sur le PDMS appelé « accélérateur d’évolution » (EA), qui permet des études in vitro parallèles de la dynamique des cellules cancéreuses à la résolution cellulaire avec l’acquisition de données en temps réel sur le cours de semaines, tout en maintenant de façon stable des gradients de stress à travers le paysage culturel. La conception de cette plate-forme est basée sur nos travaux précédents, dans lesquels la dynamique évolutive des organismes dans une métapopulation peut être accélérée10,11. Plus précisément, dans un groupe de populations spatialement séparées qui interagissent à un certain niveau, lorsqu’elles sont exposées à un paysage de stress hétérogène, les espèces les plus aptes peuvent dominer plus rapidement dans une population locale que celle d’une grande population uniforme. Les espèces avantageuses migrent ensuite vers les microhabitats voisins à la recherche de ressources et d’espace, et finissent par dominer toute la population. Comme le montre la figure 1, le modèle de la puce EA microfluidique est composé de (i) une paire de canaux serpentins qui fournissent une circulation médiatique fraîche et construisent des conditions limites fixes pour la diffusion chimique, et (ii) la région de culture cellulaire hexagonale qui se compose de 109 chambres hexagonales interconnectées et 24 chambres semi-hexagonales au centre, ressemblant à une structure en nid d’abeilles. La puce est de 100 m de profondeur. Les canaux médiatiques et la région de la culture cellulaire sont reliés à de petites fentes (environ 15 m de large), qui empêchent le flux direct des médias et le stress de cisaillement qui en résulte dans la zone de culture cellulaire, tout en permettant aux produits chimiques de se diffuser à travers de petites fentes et d’échanger des nutriments, déchets métaboliques, etc. La génération de gradients chimiques est démontrée dans la figure 1B, où un canal média contient 0,1 mM de fluorescéine tandis que l’autre canal est exempt de fluorescéine. Les cellules sont cultivées sur une membrane perméable au gaz, encapsulées par les microstructures par la pression arrière positive sur la membrane contre la puce. Les composants du support de l’appareil sont illustrés dans la figure 2, et la configuration expérimentale est illustrée dans la figure 3, où la culture est maintenue sur un microscope inversé à 37 oC, avec une humidité relative supérieure à 85 %, et conditionnée sous composition du gaz normoxia.
Ce système fournit une observation détaillée des interactions cellulaires localisées par l’intermédiaire de canaux lumineux et fluorescents et permet des essais en aval résolus spatialement tels que l’immunofluorescence, la tache occidentale, ou la spectrométrie de masse. Nous avons déjà démontré comme preuve de principe de ce modèle microfluidique de cancer-sur-puce sur la co-culture à long terme des cellules cancéreuses de la prostate de PC3 épithélial et mésenchymal12 aussi bien que l’émergence du géant polyploïde de drogue-résistance cellules cancéreuses utilisant la lignée cellulaire épithéliale PC313. Tandis que nous présentons l’application de cette plate-forme pour comprendre la dynamique spatiotemporale des cellules épithéliales DE CANCER de la prostate et de la prostate mésenchymale sous un gradient de stress du docétaxel, le système microfluidique peut être facilement appliqué à n’importe quelle combinaison des lignées cellulaires et les gradients de ressources (c.-à-d. médicaments, nutriments, oxygène).
Protocol
Representative Results
Discussion
La culture cellulaire conventionnelle a été développée il y a près d’un siècle et demeure le modèle préclinique le plus fréquemment utilisé dans la recherche biomédicale, malgré sa capacité limitée prouvée de prédire les résultats cliniques dans le cancer17. Les modèles animaux offrent la plus grande pertinence physiologique et la similitude génétique raisonnable avec les humains, mais ont longtemps été reconnus pour avoir des limites significatives dans la prévision des ré…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par NSF PHY-1659940.
Materials
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
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