Generazione di gradienti di farmaci eterogenei in tutte le popolazioni di cancro su un acceleratore evoluzione microfluidico per l'osservazione in tempo reale
Summary
Vi presentiamo un modello microfluidico cancro su chip, la tecnologia “Evolution Accelerator”, che fornisce una piattaforma controllabile per studi quantitativi a lungo termine in tempo reale della dinamica del cancro all’interno di condizioni ambientali ben definite a singola cellula livello. Si prevede che questa tecnologia funzionerà come modello in vitro per la ricerca fondamentale o lo sviluppo di farmaci preclinici.
Abstract
La coltura cellulare convenzionale rimane il modello preclinico più utilizzato, nonostante la sua capacità limitata di prevedere i risultati clinici nel cancro. Sono stati proposti modelli microfluidici cancero-su chip per colmare il divario tra le colture 2D convenzionali semplificate e i modelli animali più complicati, che hanno una capacità limitata di produrre risultati quantitativi affidabili e riproducibili. Qui, presentiamo un modello microfluidico cancro su chip che riproduce i componenti chiave di un microambiente tumorale complesso in modo completo, ma è abbastanza semplice da fornire solide descrizioni quantitative delle dinamiche tumorali. Questo modello microfluidico cancro su chip, l'”Acceleratore evoluzione”, scompone una grande popolazione di cellule tumorali in una serie interconnessa di microambienti tumorali generando un paesaggio di stress chemioterapico eterogeneo. La progressione e la dinamica evolutiva del cancro in risposta al gradiente farmacologico possono essere monitorate per settimane in tempo reale, e numerosi esperimenti a valle possono essere eseguiti in complemento alle immagini time-lapse scattate nel corso degli esperimenti.
Introduction
Il cancro è stato sempre più riconosciuto come un ecosistema complesso che dipende non solo dalla continua disregolazione delle popolazioni di cellule mutate, ma anche dalle interazioni vitali tra le cellule tumorali e il microambiente ospite. In questo senso, il cancro si evolve su un paesaggio adattivo che si manifesta con una combinazione di fattori, tra cui un microambiente tumorale eterogeneo e un incrocio con una varietà di cellule ospiti, che contribuiscono a pressioni selettive per ulteriori cambiamenti epigenetici1,2,3. Nel contesto dei tumori solidi, la distribuzione irregolare della chemioterapeutica e di altre sfumature di risorse contribuisce alla loro eterogeneità molecolare e può svolgere un ruolo nello sviluppo della resistenza ai farmaci, una maggiore angiogenesi a particolari tumori sottopopolazioni, e anche metastasi4,5,6. Gli studi convenzionali sulla coltura cellulare 2D in vitro, pur possedendo una capacità sperimentale su larga scala e conveniente, forniscono condizioni mediche, uniformi e fisse, spesso prive del preciso controllo ambientale spaziale e temporale necessario per emulare la dinamica tumorale in vivo. Pertanto, è necessario disporre di modelli ex vivo più rappresentativi per riprodurre il microambiente tumorale prima dei modelli animali nella pipeline di sviluppo dei farmaci, al fine di una migliore previsione della progressione del cancro e di risposte ai farmaci all’interno dello stress dinamico Paesaggi. La microfluidica è stata proposta per colmare il divario tra studi sulla coltura cellulare 2D e studi sugli animali in vivo più complessi che potrebbero non essere in grado di sostenere studi quantitativi controllabili7,8,9.
Un sistema in vitro ideale per caratterizzare la dinamica delle cellule tumorali dovrebbe possedere la capacità di generare un microambiente eterogeneo per imitare le risposte cellulari adattabili che possono avvenire in un tumore, nonché consentire l’osservazione di queste dinamiche in un risoluzione a cella singola. In questo articolo, descriviamo una piattaforma di coltura cellulare microfluidica, un dispositivo basato su PDMS chiamato “Evolution Accelerator” (EA), che consente studi paralleli in vitro della dinamica delle cellule tumorali a risoluzione cellulare con acquisizione di dati in tempo reale corso di settimane, pur mantenendo stabilmente gradienti di stress in tutto il paesaggio culturale. La progettazione di questa piattaforma si basa sul nostro lavoro precedente, in cui le dinamiche evolutive degli organismi in una metapopolazione possono essere accelerate10,11. In particolare, in un gruppo di popolazioni separate spazialmente che interagiscono a un certo livello, quando esposte a un paesaggio di stress eterogeneo, le specie più in forma possono dominare in una popolazione locale più velocemente rispetto a quella di una grande popolazione uniforme. Le specie vantaggiose migrano quindi verso i microhabitat vicini in cerca di risorse e spazio, e alla fine dominano l’intera popolazione. Come mostrato nella Figura 1,il modello del chip EA microfluidico è composto da (i) una coppia di canali serpentini che forniscono una circolazione dei supporti freschi e costruiscono condizioni limite fisse per la diffusione chimica e (ii) la regione di coltura cellulare esagonale che consiste di 109 camere esagonali interconnesse e 24 camere semi-esagonali al centro, simile a una struttura a nido d’ape. Il chip è 100 m di profondità. I canali mediatici e la regione di coltura cellulare sono collegati con piccole fessure (larghe circa 15 m), che impediscono il flusso diretto dei media e il conseguente stress da taglio nell’area di coltura cellulare, ma consentono comunque alle sostanze chimiche di diffondersi attraverso piccole fessure e scambiare nutrienti, rifiuti metabolici, ecc. La generazione di gradienti chimici è illustrata nella Figura 1B, in cui un canale multimediale contiene 0,1 mM di fluoresceina mentre l’altro canale è privo di fluoresceina. Le cellule sono coltivate su una membrana permeabile a gas, incapsulata dalle microstrutture attraverso la pressione posteriore positiva sulla membrana contro il chip. I componenti del titolare del dispositivo sono illustrati nella Figura 2e la configurazione sperimentale è illustrata nella Figura 3, dove la coltura viene mantenuta al microscopio invertito a 37 , con umidità relativa superiore all’85%, e condizionata in composizione del gas normoxia.
Questo sistema fornisce un’osservazione dettagliata delle interazioni cellulari localizzate tramite canali luminosi e fluorescenti e consente analisi a valle risolte nello spazio come l’immunofluorescenza, la macchia occidentale o la spettrometria di massa. In precedenza abbiamo dimostrato come una prova di principio di questo modello microfluidico cancro su chip sulla co-coltura a lungo termine delle cellule tumorali della prostata PC3 epiteria e mesenchymal12, nonché l’emergere di cellule poliploidi di resistenza ai farmaci 12 cellule tumorali utilizzando la linea cellulare PC3 epiteliale13. Mentre presentiamo l’applicazione di questa piattaforma per comprendere la dinamica spatiotemporale del PC3 epiteliale e delle cellule tumorali della prostata mesenchymal sotto un gradiente di stress di docetaxel, il sistema microfluidico può essere facilmente applicato a qualsiasi combinazione di linee cellulari e gradienti di risorse (ad es. droghe, nutrienti, ossigeno).
Protocol
Representative Results
Discussion
La coltura cellulare convenzionale è stata sviluppata quasi un secolo fa e rimane il modello preclinico più frequentemente utilizzato nella ricerca biomedica, nonostante la sua comprovata capacità limitata di prevedere i risultati clinici nel cancro17. I modelli animali offrono la massima rilevanza fisiologica e una ragionevole somiglianza genetica con gli esseri umani, ma sono stati a lungo riconosciuti per avere limitazioni significative nella previsione degli esiti umani18<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da NSF PHY-1659940.
Materials
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
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