新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル
Summary
骨細胞の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るために、レーザー捕捉微細解剖(LCM)プロトコルが開発されました。現在の研究は、マウス大腿骨のセクションに焦点を当てています。しかしながら、ここで報告されるLCMプロトコルは、任意の硬質組織の細胞における遺伝子発現を研究するために使用することができる。
Abstract
RNAの収率と完全性は、RNA分析の決定的な方法です。しかし、多くの場合、レーザーキャプチャマイクロディスセクション(LCM)手順全体を通じてRNAの完全性を維持することは技術的に困難です。LCM研究は少量の材料で動作するため、限られたRNA収率に関する懸念も重要です。そこで、骨細胞の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るためにLCMプロトコルを開発しました。染色プロトコルの効果は、凍結切片の厚さ、微分解組織量、RNA抽出キット、および微小解剖骨細胞から得られるRNA収率および完全性に用いられるLCM系を評価した。8μm厚の凍結骨切片を粘着フィルムを用いて作製し、市販のLCM染色のための迅速なプロトコルを使用して染色した。試料をポリエチレンテレフタレート(PET)膜と粘着フィルムとの間に挟み込んだ。サンプル採取に重力を用いたLCMシステムとカラムベースのRNA抽出法を用いて、十分な収率の高品質RNAを得た。現在の研究は、マウス大腿骨のセクションに焦点を当てています。しかしながら、ここで報告されるLCMプロトコルは、生理学的条件および疾患プロセスの両方における任意の硬質組織の細胞におけるその状態遺伝子発現における研究に用いることができる。
Introduction
組織は、異種および空間的に分散した細胞タイプで構成されています。特定の組織内の異なる細胞タイプは、同じシグナルに異なる反応を示す場合があります。したがって、生理学的および病理学的条件の両方における異なる細胞型の役割の評価のために特定の細胞集団を単離できることが不可欠である。レーザー捕捉微分解子(LCM)は、複雑な組織1から指定された細胞を分離および除去するための比較的迅速かつ正確な方法を提供する。LCMシステムは、レーザービームの力を使用して、酵素処理や培養中の増殖を必要とせずに組織組織切片から目的の細胞を分離します。これは、細胞が自然組織の生息地にあり、異なる細胞間の空間的関係を含む組織構造が保持されていることを意味します。捕捉された細胞と残留組織の両方の形態はよく保存され、複数の組織成分を同じスライドから順次サンプリングすることができます。単離された細胞は、その後、そのRNA、DNA、タンパク質または代謝産物含有量2、3のその後の分析に使用することができる。
異なる細胞集団における遺伝子発現を分析するためには、または異なる処置後に、その後の分析4、5に対して十分な品質および量のmRNAを得る必要がある。DNAとは対照的に、RNAは固定に敏感であり、目的がRNAを研究する場合は凍結組織の使用が推奨されます。mRNAはユビキタスリボヌクレアーゼ(RNase)によって急速に分解されるので、試料の取り扱いや調製時の厳格なRNaseフリー条件と室温でのサンプルの保管を回避する必要があります。さらに、長期の水相段階を伴わずに迅速な技術は、RNAの劣化を防ぐために重要である6.RNAの歩留まりと完全性は、LCMプロセスおよび使用されるLCMシステム7、8の影響を受ける可能性もある。現在、動作原理が異なる4つのLCMシステムが利用可能です2.RNA抽出の方法は、異なるRNA単離キットがRNA量および品質7、8の有意な差で試験されているので、重要である場合もある。
任意の組織調製方法は、良好な形態コントラストを得ることと、さらなる分析のためにRNAの完全性を維持することとの間のバランスを見つける必要があります。骨から凍結切片を作製するために、粘着フィルムを開発し、継続的に改善した9.骨のセクションは、粘着フィルム上で直接切断され、染色されます。この粘着フィルムは、多くのタイプの染色に適用可能であり、LCM9、10、11、12、13を使用して骨凍結切除から目的の細胞を分離するために使用することができる、 14.外科的除去、埋め込み、凍結、切断および染色を含むすべてのステップは1時間以内に完了することができる。重要なことに、破骨細胞、骨内層細胞、および破骨細胞などの細胞は、9、10、11、12、13、14を明確に同定することができる。この方法は、迅速かつ簡単であるという利点があります。骨凍結切片を生成するための別の方法は、テープ転送システム15を使用することです。しかし、後者の技術は、より時間がかかり、セクションは、紫外線(UV)架橋によって前コーティングされた膜スライドに粘着テープから転送する必要があるため、追加の器械使用を必要とします。テープ転送システムはLCM16、17、18、19と正常に結合されていますが、架橋コーティングは背景パターンを作成できることに留意すべきです。細胞型識別20を妨害する可能性があります。
典型的には、微小解剖細胞から少量のRNAのみが抽出され、RNAの質および量は、しばしばマイクロキャピラリー電気泳動21によって評価される。コンピュータプログラムは、RNA整合性番号(RIN)と呼ばれるRNA抽出物に品質のインデックスを割り当てるために使用されます。RIN 値 1.0 は完全に分解された RNA を示し、10.0 の値は RNA が完全に22であることを示します。通常、5を超えるインデックスはRNA研究に十分と考えられています。RIN値が5.0−10.0のサンプルにおける遺伝子発現パターンは、互いに23とよく相関することが報告されている。この方法の感度は高いが、総RNAの50pg/μLが検出できるため、試料中のRNA濃度が非常に低い場合に品質評価を得ることは非常に困難である。したがって、RNA品質を評価するために、LCM後に残存する組織部は、多くの場合、スライド24上にバッファをピペッティングすることによってRNAを抽出するために使用される。
LCMは異なる凍結組織に広く使用されていますが、抽出されたRNAのRIN値が報告されることはほとんどありません。さらに、マウスの骨中のRNAを研究するための最も適切な方法を明らかにする比較研究はありません。本研究では、成虫マウス大腿骨からの凍結切片を用いて、高品質のRNAを得るためにサンプル調製、LCMプロトコルおよびRNA抽出を最適化した。本プロトコルは、特にサンプル収集に重力を使用するLCMシステム用に最適化された。
Protocol
Representative Results
Discussion
RNAの質および量は両方とも、組織操作、LCMプロセス、RNA抽出などのサンプル調製のすべての段階で負の影響を受ける可能性があります。そこで、その後の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るためにLCMプロトコルを開発した。
LCMの場合、ほとんどの実験室ではセクション7−8 μm厚さ2を使用しています。より厚いセクションは、より多くの材料を収穫する?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、彼らの優れた技術的な助けだけでなく、彼らのサポートのためのVetcoreと動物ケアスタッフのためのUte ZeitzとニコルGinnerに感謝します。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689-25ML-F | |
| Absolute ethanol EMPLURA | Merck Millipore | 8,18,76,01,000 | |
| Adhesive film (LMD film) | Section-Lab | C-FL001 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies | ||
| Agilent RNA 6000 Pico Chip Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus HistoGene Staining Solution | Applied Biosystems | 12241-05 | |
| Cryofilm fitting tool | Section-Lab | C-FT000 | |
| Cryostat Leica CM 1950 | Leica Biosystems | ||
| glass microscope slides, cut colour frosted orange | VWR Life Science | 631-1559 | |
| Histology tissue molds PVC | MEDITE | 48-6302-00 | |
| LMD7 Laser Mikrodissektion System | Leica Microsystems | ||
| Low profile Microtome Blades Leica DB80 XL | Leica Biosystems | 14035843496 | |
| Nuclease-free water | VWR Life Science | E476-500ML | |
| PET membrane slides 1.4 mircon | Molecular Machines & Industries GmbH | 50102 | |
| RNase Away surface decontaminant | Molecular BioProduct | 7002 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Xylene | VWR Life Science | 2,89,73,363 |
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