Obtention av Giant Unilamellære hybrid blemmer av Electroformation og måling av deres mekaniske egenskaper ved Micropipette aspirasjon
Summary
Målet med protokollen er å pålitelig måle membran mekaniske egenskaper gigantiske blemmer ved micropipette aspirasjon.
Abstract
Gigantiske blemmer innhentet fra fosfolipider og kopolymerer kan utnyttes i ulike programmer: kontrollert og målrettet narkotika levering, Biomolecular anerkjennelse innen biosensors for diagnostisering, funksjonelle membraner for kunstige celler, og utvikling av bioinspired mikro/nano-reaktorer. I alle disse programmene, karakterisering av deres membran egenskaper er av fundamental betydning. Blant eksisterende karakterisering teknikker, micropipette aspirasjon, utviklet av E. Evans, tillater måling av mekaniske egenskaper av membranen som areal Komprimerbar modul, bøying modul og lyse stress og belastning. Her presenterer vi alle metoder og detaljerte prosedyrer for å få gigantiske blemmer fra tynn film av en lipid eller kopolymer (eller begge), produksjon og overflatebehandling av Mikropipetter, og aspirasjon prosedyre som fører til måling av alle parametrene tidligere nevnt.
Introduction
Gigantiske blemmer innhentet fra fosfolipider (liposomer) har vært mye brukt siden 1970-tallet som den grunnleggende celle membran modell1. På slutten av 1990-tallet, flytande morfologier innhentet fra selv-montering av kopolymerer, oppkalt polymersomes i referanse til sine lipid analogs2,3, raskt dukket opp som et interessant alternativ til liposomer som har svak mekanisk stabilitet og dårlig modulær kjemisk funksjonalitet. Imidlertid er deres celle BioMimetic karakter ganske begrenset i forhold til liposomer siden sistnevnte er sammensatt av fosfolipider, den viktigste komponenten i cellemembranen. Videre kan deres lave membran permeabilitet være et problem i enkelte programmer som legemiddellevering der kontrollert diffusjon av arter gjennom membranen er nødvendig. Nylig har foreningen av fosfolipider med blokk kopolymerer til design hybrid polymer-lipid blemmer og membraner vært gjenstand for et økende antall studier4,5. Den viktigste ideen er å designe enheter som synergi kombinere fordelene med hver komponent (bio-funksjonalitet og permeabilitet av lipid bilayers med mekanisk stabilitet og kjemisk allsidighet av polymer membraner), som kan utnyttes i ulike programmer: kontrollert og målrettet narkotika levering, Biomolecular anerkjennelse innen biosensors for diagnose, funksjonelle membraner for kunstige celler, utvikling av bio-inspirerte mikro-/nano-Reactors.
I dag har ulike vitenskapelige miljøer (Biokjemikere, kjemikere, biophysicists, fysikalsk-kjemikere, biologer) økende interesse for utvikling av en mer avansert celle membran modell. Her er vårt mål å presentere, så detaljert som mulig, eksisterende metoder (electroformation, micropipette aspirasjon) for å få og karakterisere de mekaniske egenskapene til gigantiske blemmer og de siste “avanserte” celle membran modeller som er hybrid polymer lipid gigantiske blemmer4,5.
Hensikten med disse metodene er å oppnå pålitelig måling av området Komprimerbar og bøying moduli av membranen, samt deres lyse Rings stress og belastning. En av de vanligste teknikkene som eksisterer for å måle bøying stivhet av en gigantisk vesicle er svingninger analyse6,7, basert på direkte video mikroskop observasjon; men dette krever store synlige membran svingninger, og er ikke systematisk innhentet på tykke membraner (f. eks polymersomes). Areal Komprimerbar modul kan være eksperimentelt bestemmes ved hjelp av Langmuir Blodgett teknikk, men oftest på en monolag8. Den micropipette aspirasjon teknikken gjør at måling av både moduli på en bilayer forming gigantiske unilamellære vesicle (GUV) i ett eksperiment.
Følgende metode er hensiktsmessig for alle amfifile molekyler eller makromolekyler stand til å danne bilayers og følgelig blemmer av electroformation. Dette krever en væske karakter av bilayer ved temperaturen på electroformation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belegget på micropipette er en av hovedpunktene for å oppnå pålitelige målinger. Vedheft av vesicle til micropipette må forebygges, og et belegg er vanligvis brukt i litteraturen17,18,19,20,21, med BSA, β-kasein eller surfasil. Detaljer om belegget prosedyren er sjelden nevnt.
Oppløsningen av BSA skal utføres i minst 4 time…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takknemlig erkjenner ANR for økonomisk støtte (ANR sysa).
Materials
| Required equipment and materials for micropipette design | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | external and internal diameter of 1mm and 0.58 mm respectively. |
| Filament installed | Sutter Instrument Co. | FB255B | 2.5mm*2.5mm Box Filament |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Microforge | NARISHGE Co. | MF-900 | fitted with two objectives (10x and 32x) |
| Materials for coating pipette tips with BSA | |||
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | 10735078001 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| Disposable 10 ml syringe Luer Tip | Codan | 626616 | |
| Disposable 5 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.5607 | |
| Disposable acetate cellulose filter | Cluzeau Info Labo | L5003SPA | Pore size: 0.22µm, diameter: 25mm |
| Flexible Fused Silica Capillary Tubing | Polymicro Technologies. | TSP530660 | Inner Diameter 536µm, Outer Diameter 660µm, |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Syringe 500 µL luer Lock GASTIGHT | Hamilton Syringe Company | 1750 | |
| Test tube rotatory mixer | Labinco | 28210109 | |
| Micromanipulation Set up | |||
| Aluminum Optical Rail, 1000 mm Length, M4 threads, X48 Series | Newport | ||
| Damped Optical Table | Newport | used as support of microscope to prevent external vibrations. | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP 2 | The module unit (motor unit for X, Y and Z movement) is mounted on the inverted microscope by the way of an adapter. |
| Micrometer | Mitutoyo Corporation | 350-354-10 | Digimatic LCD Micrometer Head 25,4 mm Range 0,001 mm |
| Plexiglass water reservoir (100 ml) | Home made | ||
| TCS SP5 inverted confocal microscope (DMI6000) equipped with a resonant scanner and a water immersion objective (HCX APO L 40x/0.80 WU-V-I). | Leica | ||
| X48 Rail Carrier 80 mm Length,with 1/4-20, 8-32 and 4-40 thread | Newport | ||
| Materials for sucrose and amphiphile solution preparation | |||
| 2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Sigma-Aldrich | ||
| Chloroform | VWR | 22711.244 | |
| L-α-Phosphatidylethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) | Sigma-Aldrich | 810146C | Rhodamine tagged lipid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Electroformation set up | |||
| 10 µL glass capillary ringcaps | Hirschmann | 9600110 | |
| Disposable 1 ml syringe Luer Tip | Codan | 62.1612 | |
| H Grease | Apiezon | Apiezon H Grease | Silicon-free grease |
| Indium tin oxide coated glass slides | Sigma-Aldrich | 703184 | |
| Needle | Terumo | AN2138R1 | 0.8 x 38 mm |
| Ohmmeter (Multimeter) | Voltcraft | VC140 | |
| Toluene | VWR | 28676.297 | |
| Voltage generator | Keysight | 33210A |
References
- Bangham, A. D., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), (1965).
- Discher, D. E., Eisenberg, A. Polymer vesicles. Science. 297 (5583), 967-973 (2002).
- Hammer, D., et al. Polymersomes: vesicles from block copolymers. Annals of Biomedical Engineering. 28 (SUPPL. 1), (2000).
- Le Meins, J. F., Schatz, C., Lecommandoux, S., Sandre, O. Hybrid polymer/lipid vesicles: state of the art and future perspectives. Materials Today. 16 (10), 397-402 (2013).
- Schulz, M., Binder, W. H. Mixed Hybrid Lipid/Polymer Vesicles as a Novel Membrane Platform. Macromolecular Rapid Communications. 36, 2031-2041 (2015).
- Schneider, M. B., Jenkins, J. T., Webb, W. W. Thermal fluctuations of large quasi-spherical bimolecular phospholipid vesicles. Journal De Physique. 45 (9), 1457-1472 (1984).
- Dimova, R. Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes. Advances in Colloid and Interface Science. 208, 225-234 (2014).
- Rodríguez-García, R., et al. Polymersomes: smart vesicles of tunable rigidity and permeability. Soft Matter. 7 (4), 1532-1542 (2011).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
- Dao, T. P. T., et al. Membrane properties of giant polymer and lipid vesicles obtained by electroformation and pva gel-assisted hydration methods. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 533, 347-353 (2017).
- Pereno, V., et al. Electroformation of Giant Unilamellar Vesicles on Stainless Steel Electrodes. ACS omega. 2 (3), 994-1002 (2017).
- Evans, E., Rawicz, W. Entropy-driven tension and bending elasticity in condensed-fluid membranes. Physical Review Letters. 64 (17), 2094-2097 (1990).
- Dao, T. P. T., et al. Modulation of phase separation at the micron scale and nanoscale in giant polymer/lipid hybrid unilamellar vesicles (GHUVs). Soft Matter. 13 (3), 627-637 (2017).
- Helfrich, W. Elastic properties of lipid bilayers: theory and possible experiments. Z Naturforsch C. 11 (11), 693-703 (1973).
- Dao, T. P. T., et al. The combination of block copolymers and phospholipids to form giant hybrid unilamellar vesicles (GHUVs) does not systematically lead to "intermediate” membrane properties. Soft Matter. 14 (31), 6476-6484 (2018).
- Shoemaker, S. D., Kyle Vanderlick, T. Material Studies of Lipid Vesicles in the Lα and Lα-Gel Coexistence Regimes. Biophysical Journal. 84 (2), 998-1009 (2003).
- Longo, M. L., Ly, H. V., Dopico, A. M. . Methods in Membrane Lipids. , 421-437 (2007).
- Chen, D., Santore, M. M. Hybrid copolymer-phospholipid vesicles: phase separation resembling mixed phospholipid lamellae, but with mechanical stability and control. Soft Matter. 11 (13), 2617-2626 (2015).
- Mabrouk, E., et al. Formation and material properties of giant liquid crystal polymersomes. Soft Matter. 5, 1870-1878 (2009).
- Henriksen, J., et al. Universal behavior of membranes with sterols. Biophysical Journal. 90 (5), 1639-1649 (2006).
- Ly, H. V., Block, D. E., Longo, M. L. Interfacial Tension Effect of Ethanol on Lipid Bilayer Rigidity, Stability, and Area/Molecule: A Micropipet Aspiration Approach. Langmuir. 18 (23), 8988-8995 (2002).
- Bermudez, H., Hammer, D. A., Discher, D. E. Effect of Bilayer Thickness on Membrane Bending Rigidity. Langmuir. 20, 540-543 (2004).
