هنا ، ونحن نقدم الأكسجين التدرج ektacytometry ، وهي طريقه سريعة وقابله للتكرار لقياس خلايا الدم الحمراء الخلايا في عينات من المرضي الذين يعانون من مرض الخلية المنجلية تحت الأوكسجين الخاضعة للرقابة وأعاده الأوكسجين. توفر هذه التقنية طريقه لدراسة مرض خلايا الدم الحمراء ولمراقبه فعاليه علاج امراض الخلايا المنجلية.
في مرض الخلايا المنجلية (SCD) ، طفرة نقطه واحده في الترميز الجيني لبيتا جلوبين يسبب إنتاج الهيموغلوبين غير طبيعي S (HbS). عندما deoxygenated ، يمكن ان تتبلمر HbS ، وتشكيل قضبان جامده من الهيموغلوبين ، مما ادي إلى مرض خلايا الدم الحمراء (RBCs). وقد خفضت هذه RBCs المسببة للخلايا بشكل كبير ، مما تسبب في انسداد فاسو ، مما يؤدي إلى العديد من المضاعفات السريرية المتعلقة SCD ، بما في ذلك الم والسكتة الدماغية ، وتلف الجهاز. كما يتم تقليل الخلايا ار بي سي بسبب الجفاف ار بي سي ، مما ادي إلى خلايا الدم الحمراء الكثيفة التي من المرجح ان المنجل. وحتى الآن ، لا يوجد فحص مختبري واحد متاح علي نطاق واسع وسريع وقابل للتكرار قادر علي التنبؤ بشده المرض أو الرصد المباشر للآثار العلاجية لعلاجات الهيموغلوبين المبتكرة غير الجنينية. في هذه الدراسة ، ونحن وصف بروتوكول لقياس ار بي سي الخلايا كوظيفة من pO2 التي تسمح لكميه من السلوك المقزز في المرضي scd. يقيس [اكتاكيوتومتري] أكسجين تدرج [ربك] الخلايا, يعبر كالاستطالة فهرسه ([اي]), كداله من [بو]2. وتتعرض RBCs للإجهاد القص ثابته من 30 باسكال خلال جولة واحده من الأوكسجين وأعاده الأوكسجين. يتم إنتاج سته معلمات قراءات. من هذه, نقطه المقززة (PoS), تعرف باسم pO2 الذي الحد الأقصى EI (eiماكس) يظهر انخفاض 5%, والحد الأدنى ei خلال الأوكسجين (eimin) هي الأكثر بالمعلومات, مما يعكس المريض الفرد2 في الذي يبدا المرض والخلايا الحد الأدنى من خلايا الدم الحمراء للمريض ، علي التوالي. ويرتبط نقاط البيع مع تقارب الهيموغلوبين المريض الفردية للأكسجين, بينما EImin يظهر ارتباط قوي مع مستويات الهيموغلوبين الجنينية. نستنتج ان الأكسجين التدرج اكتاكيتومتري هو تقنيه واعده لرصد علاج المرضي الذين يعانون من SCD ، كمؤشر حيوي للعوامل المضادة للمرض في التجارب السريرية والسريرية ، وأداه هامه لدراسة السلوك المقزز من RBCs من الافراد مع SCD وسمات الخلية المنجلية.
في SCD ، الطفرة نقطه واحده النتائج في إنتاج HbS ، والتي يمكن ان تتبلمر علي الاكسده. يسبب البلمره HbS مرض RBCs ويقلل من الخلايا الكريات الكروية. ان الجمع بين الاصابه بالمرض والتصاق بالبطانة يؤدي إلى مضاعفات SCD مختلفه ، بما في ذلك ألازمات المزمنة (VOC) ، والسكتة الدماغية ، وتلف الأعضاء ، وفقر الدم الانحلالي. حتى في ظروف نورموكسيك ، الخلايا ار بي سي يتعرض للخطر في المرضي الذين يعانون من SCD. كما انخفض الخلايا في تركيزات الأكسجين المنخفضة. اللاعبون الرئيسيون الذين يحددون الخلايا في normoxia هم خلايا كثيفه ، خلايا مصابه بالمرض بشكل لا رجعه فيه ، والخلايا المجففة ، وكلها لها انخفاض نسبه سطح إلى حجم1،2،3.
اكتاكيتومتري هو أسلوب راسخ لقياس الخلايا ار بي سي ، وتستخدم علي نطاق واسع لتشخيص الأنيميا الانحلالية الوراثية ، ولا سيما ميمبرانوباثيس4. ويمكن أيضا ان تستخدم لدراسة هيمورهيولوجي5,6,7,8,9. وقد استخدمت اوسموتيك التدرج ektacytometry ، والتي يتم فيها قياس ار بي سي الخلايا خلال التغيير المستمر في العلاقة العامة ، لدراسة SCD لأكثر من عقد10،11. النسبة المئوية من الهيموغلوبين الجنيني (HbF) هي واحده من اقوي مثبطات البلمره Hbf لأنه لا HbF ولا رباعيه هجين مختلطة (∝ 2βSγ) يمكن ان تدخل المرحلة البوليمر deoxyHbS12. تشير الدراسات الاخيره إلى ان زيادة مستويات HbF في مرضي SCD يؤدي إلى نسبه أفضل من سطح إلى حجم ، التالي تحسين حاله الترطيب التالي الخلايا في المرضي غير المتحولين11.
وقد درست الخلايا ار بي سي في الماضي كمؤشر حيوي لمضاعفات SCD ، ولكن مع نتائج متضاربة. في الدراسات التي أجريت عبر سيكتيونالي وفي حاله مستقره ، تم العثور علي الافراد الذين لديهم مستويات اعلي من الخلايا الكروية لديهم نسبه اعلي من الاصابه بالعظام والمزيد من أزمات الم13،14،15. وعلي النقيض من هذه النتائج ، بالمقارنة مع قيم الدولة الثابتة خلال الحاده المتطايرة ، انخفضت الخلايا الكريات الكروية في الدراسات الطولية داخل نفس الافراد16. قد يكون هذا التباين نتيجة لدراسة الخلايا ار بي سي تحت ظروف مختلفه (اي اثناء الحالة الثابتة مقابل VOC). النسبة المئوية للخلايا المريضة مرتفعه في بداية الخلايا المتطايرة ويتم تدميرها بسرعة مع تقدم ألازمه ، وهو ما قد يفسر الفرق بين بيانات الحالة الثابتة عبر القطاعات والبيانات الطولية التي يتم الحصول عليها اثناء الصمام المتطاير. ومع ذلك ، قد تكون عوامل أخرى ، مثل الانضمام إلى السكان الفرعيين ار بي سي إلى السطح البطانية ، أيضا مهمة في حدوث VOC. في SCD ، فمن أكثر اهميه سريريا لقياس الخلايا اثناء الاكسده ، لان الانسداد فاسو يحدث عاده في الحويصلات الشعرية اللاحقة لنقص الأكسجين وليس في اقل نقص الأكسجين المجهرية شبكه17. بالاضافه إلى ذلك ، قد يغير وجود ISCs قدره ektacytometer لقياس الخلايا في normoxia. ويتسبب تشويه نمط الانكسار من قبل iscs ، والذي ينتج عن عدم المحاذاة اثناء التدفق1،2،3.
وتشمل النهج البديلة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لل VOC قياسات الانضمام إلى الخلايا الخلوية الاصطناعية18، خليه واحده مقاومه الكهربائية الخلوية التدفق الحجمي19، النماذج القائمة علي microfluidic الجمع بين الكمية قياسات الخلية المريضة والمصابة بالسيلان مع خليه واحده ريولوجي20، والليزر المستحث البلمره21. وعلي الرغم من ان هذه التقنيات واعده ، فانها مكلفه وكثيفه العمالة وتتطلب تدريبا مكثفا للمشغلين. الاضافه إلى ذلك ، فان المقايسات التي تستند إلى المورفولوجية تفتقر إلى القدرة علي دراسة السلوك الخلوي ، مثل الخلايا ، كداله لتدرج الأكسجين.
في هذه الدراسة ، ونحن وصف الفحص الوظيفي السريع واستنساخه التي أجريت مع ektacytometer. هذا هو الجيل القادم من قياس ektacytometry الذي يقيس الجوانب النوعية المختلفة للخلايا ار بي سي وأعرب عن EI خلال الأوكسجين (1,300 s) وسريعة الأوكسجين (280 s). هذه الفواصل الزمنيه تسمح لتشكيل البوليمر HbS ، التالي حدوث التغييرات المورفولوجية ومن ثم الانتعاش. يحدث الاكسده عن طريق إدخال غاز النيتروجين ، الذي يقلل ببطء من توتر الأكسجين في عينه الدم في الفجوة بين بوب وكوب من ektacytometer. يتم قياس الخلايا ار بي سي بشكل مستمر في حين يتم قياس التوتر الأوكسجين كل 20 ثانيه عن طريق الصغيرة O2-بقعه الحاضر في جدار الكاس. اثناء الاختبار, تقريبا 80 [بو]2 اقترنت قياسات إلى ال [اي] يقاس [آت ي فور]. ينخفض ضغط الأكسجين إلى اقل من 20 مم زئبق اثناء الاكسده ، ويتم تسهيل أعاده الأوكسجين من خلال الانتشار السلبي للهواء المحيط. يتم وصف الاعداد التجريبي للوحدة النمطية اكتاكيتومتري وتدرج الأكسجين في الشكل 1 والشكل 2. ويستند مبدا ektacytometry علي نثر المستحثة بالاشعه السينية من الضوء من شعاع الليزر. وينتج عن ذلك نمط انكسار اهليلجيه عند تطبيق الضغط القص في نفس الوقت (الشكل 1).
هنا نحن وصف الأكسجين التدرج ektacytometry ، وهي الطريقة التي يمكن استخدامها لدراسة سلوك مقزز من خلايا الدم الحمراء من المرضي SCD تحت مجموعه من تركيزات الأكسجين (الشكل 4 والشكل 5). من أجل الحصول علي نتائج قابله للتكرار ، من المهم تحديد العوامل التي تؤثر علي النتائج. علي سبيل المثال ، درجه الحرارة لها تاثير كبير علي الخلايا ار بي سي ، ويرجع ذلك في الغالب إلى اثارها علي سمك محلول لزج (PVP). نوصي باجراء قياس اختبار في بداية اليوم لتسخين الجهاز بدقه إلى 37 درجه مئوية. سيؤدي ذلك إلى تحسين استنساخ النتائج. يجب ان يكون المحلول اللزج داخل نطاق ضيق (282 – 286 mOsm/kg لPVP) ، لان الطحالب تؤثر علي حاله الترطيب ، والتي تؤثر بدورها علي الخلايا الخلوية. وينبغي أيضا ان الأس الهيدروجيني واللزوجة من PVP ينظم باحكام. الاختلافات في الأس الهيدروجيني ودرجه الحرارة يمكن ان تؤثر علي منحنيات بشكل كبير22. بالاضافه إلى ذلك ، المياه المتبقية في الكاس ، بوب ، والأنابيب ، قد يسبب تحلل RBCs ، مما يؤدي إلى بيانات غير صحيحه ، لأنه سيتم قياس اقل من RBCs سليمه الموجودة في الكاس.
يمكن تعديل إعدادات لأداء الأكسجين التدرج ektacytometry لمعالجه الاسئله البحثية محدده. يتم سرد الإعدادات المفضلة في الجدول 1. تم اختيار وقت دياوكسجين من 1,300 s استنادا إلى الملاحظات التي تبين ان تمديد الأوكسجين لم يسفر عن انخفاض الحدالأدنى EI لمعظم المرضي. وعلي النقيض من ذلك ، فان تقصير وقت الأوكسجين من شانه ان يعوق القوه التمييزية لمقياس الأكسجين المتدرج. تم تعيين الوقت لأعاده الأوكسجين إلى 280 s بسبب البوليمرات HbS حل بسرعة اثناء أعاده الأوكسجين ، ويصاحب ذلك استعاده EI نحو القيم التي تقاس قبل الاكسده. تم تعيين الإجهاد القص إلى 30 باسكال ، وهو ما يماثل التدرج اللوني العثماني. خفض هذه المعلمة يمكن ان يعوق السلطة التمييزية. يمكن استخدام التحكم في الاكسده إذا تم تطبيق مجموعه من سرعه الأوكسجين علي كل عينه مريضه. في الإعدادات المفضلة لدينا ، تم إيقاف هذا الخيار لان معدل الاكسده هو محدد المريض بسبب منحني التفكك الهيموغلوبين فريدة من نوعها. التالي ، فان التحول علي السيطرة علي أزاله الأوكسجين القضاء علي هذه الخاصية من الفحص. ومع ذلك ، هذه الميزة من الأكسجين التدرج اكتاكيتومتري لا يزال قيد التحقيق.
العديد من العوامل المعروفة تؤثر علي المعلمات التدرج الأكسجين اكتاكيتومتري ، وهي الأس الهيدروجيني ، ودرجه الحرارة ، و osmolarity. [اكتاكيتومتري], بشكل خاص [بوس], أثرت ب 2, 3-[ديفوسغليسرريت] (2, 3-دبغ])22. أيضا ، هناك ارتباط واضح بين% HbF و EImin، والي حد اقل نقاط البيع (الشكل 5ا–د). ويرتبط EImax مع الخلايا المنجلية في normoxia ، والتي يمكن ان تفسر الملاحظة التي بعد فتره وجيزة من VOC ، الخلايا ار بي سي في NORMOXIA (EImax) ، هو اعلي. والسبب الأخير هو تدمير الخلايا الأكثر مرضا ، التالي اقل تشوه RBCs خلال VOC16. كما هو مبين في الشكل 5و, اعلي ٪ rbcs الكثيفة (تعرف باسم rbcs مع تركيز الهيموغلوبين ≫ 1.11 مغ/مل) ترتبط بقوة مع انخفاض EImax. وهذا يشير إلى ان الخلايا الكثيفة هي عامل مهم في الخلايا ار بي سي في normoxia, مماثله للنتائج المبلغ عنها سابقا1.
توحيد العينات مهم جدا للحصول علي نتائج قابله للتكرار والتمييز بين مختلف الأنماط الجينية والعلاجات. التصحيح لعدد الكريات الكروية مهم ، حيث ان عدد RBCs يؤثر علي شده نمط الانكسار. إذا كانت أرقام ار بي سي اقل موجودة في الفجوة بين بوب والكاس ، فان منحني التحول إلى الأعلى والي اليسار. بالاضافه إلى ذلك ، ستتقلب المنحني ، مما يعوق الحساب الدقيق للمعلمات ، وخاصه نقاط البيع.
والحد من هذه التقنية هو ان قيمه EI تمثل متوسطا لجميع الخلايا ، بما في ذلك الفئات الفرعية المختلفة. وقد تم بشكل مكثف دراسة التغاير من السكان ار بي سي في المرضي SCD وتاثيره علي قياس اكتاكيتومتري. وادي ذلك إلى التوحيد القياسي حيث تم تعديل حجم نمط الانكسار إلى قيمه ثابته بدلا من تصحيحها لعدد الكريات23،24. وما إذا كانت هذه الطريقة للتوحيد القياسي ينبغي ان تطبق أيضا علي قياسات الأكسجين المتدرج التدرج قيد الدراسة حاليا.
تم تطوير العديد من التقنيات لقياس ار بي الخلايا تحت ظروف نقص الأكسجين علي أساس خطوه الاكسده التي وقعت خارج ektacytometer25,26,27. في ظل هذه الظروف ، لم يلاحظ الاختلافات في السلوك الخلوي بين المرضي الذين يعانون من الصفات HbS والضوابط الصحية تحت pH الفسيولوجية25. الأكسجين التدرج ektacytometry ، ومع ذلك ، يظهر بوضوح نقاط البيع منخفضه ولكن واضحة في الافراد مع الصفات HbS (الشكل 4ا). حتى الآن ، في الممارسة السريرية الروتينية ، والطرق البديلة الوحيدة لقياس الميل من RBCs المريض الفردية إلى المنجل في المختبر وتشمل فحص المورفولوجية القائم علي التشكل: يتم احتضان RBCs تحت الظروف التي تعزز البلمره HbS ، مثل انخفاض التوتر الأكسجين أو انخفاض درجه الحموضة. يتم أضافه المثبت بعد الحضانة والنسبة المئوية للخلايا المريضة يتم احتسابها يدويا أو رقميا باستخدام المجهر الضوئي. العديد من التجارب الدوائية قبل السريرية والمرحلة المبكرة استخدام فحص مقزز لتوليد متغير النتيجة الثانوية لتكون قادره علي التنبؤ بالفعالية السريرية في scd28,29,30,31 ،32. ومع ذلك ، فمن مضيعه للوقت ، وتقلب عاليه وحساسية منخفضه ، وتقنيه ليست مؤتمتة ، التالي ، والعمالة المكثفة. وعلاوة علي ذلك ، فان التغييرات المورفولوجية الناجمة عن المرض قد لا ترتبط بشكل جيد مع المعلمات الفسيولوجية ، مثل الخلايا ار بي سي ، لأنها اختبار ثابت ثنائي الابعاد2.
الأكسجين التدرج ektacytometry يوفر فحص وظيفية من المرض الذي هو سريع واستنساخه. هذا هو اختبار في المختبر الذي لا يعتبر سطح بطانية. ومع ذلك ، فانه يوفر جوانب وظيفية من السلوك المقزز وخصائص ار بي سي ، مما يجعلها تقنيه واعده للدراسات الخلايا المنجلية. وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية رصد فعاليه العلاج في المرضي SCD ، بمثابه الحيوية لاستراتيجيات العلاج الجديدة ، ودراسة السلوك المقزز ، ورصد تشيميريسم بعد زرع الخلايا الجذعية في SCD.
The authors have nothing to disclose.
وكان هذا العمل مدعوما جزئيا بمنحه من “يوروستارز” estar18105 وبمنحه غير مقيده قدمتها اللوائح الكترونيه للوائح الراديو. ويشكر أصحاب البلاغات كلا من السيد سيتن هيندريكس وجان دي زوتين علي دعمهما الفني.
ADVIA 120 Hematology Analyzer | Siemens | 067-A004-14 | Instrument |
Cell-Dyn Sapphire Hematology Analyzer | Abbott | 8H00-01 | Instrument |
Lorrca | RR Mechatronics | LORC109230 or LORC109110 | Instrument |
Lorrca Software version V5.08 | RR Mechatronics | – | Software |
Nitrogen gas 4.8 or 5.0 | Local | – | |
O2-spot | RR Mechatronics | PO2S020153 | O2 measurement |
Oxygenscan module (pO2scan) | RR Mechatronics | PO2S109000 | Add-on |
Oxy-ISO | RR Mechatronics | QRR 030905 | Viscous solution |
X-Clean | RR Mechatronics | QRR 010946 | Cleaning solution Lorrca |