Drosophila पुरुष सहायक Glands के माध्यमिक कोशिकाओं से आरएनए अलग करने के लिए एक FACS आधारित प्रोटोकॉल
Summary
यहाँ, हम आरएनए अनुक्रमण और आरटी-क्यूपीसीआर के लिए Drosophila पुरुष सहायक ग्रंथियों (माध्यमिक कोशिकाओं) से एक विशिष्ट सेल आबादी को अलग और सॉर्ट करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। सेल अलगाव एक multistep-dissociation प्रक्रिया विच्छेदन की आवश्यकता होती है के बाद GFP-expressing माध्यमिक कोशिकाओं के FACS शुद्धि के माध्यम से पूरा किया है, proteases पाचन और यांत्रिक फैलाव.
Abstract
एक अंग के कार्य को समझने के लिए, यह अक्सर अपने घटक कोशिका आबादी की भूमिका को समझने के लिए उपयोगी है. दुर्भाग्य से, व्यक्तिगत सेल आबादी की दुर्लभता अक्सर यह मुश्किल आणविक अध्ययन के लिए पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने के लिए बनाता है. उदाहरण के लिए, Drosophila पुरुष प्रजनन प्रणाली के सहायक ग्रंथि दो अलग स्रावी सेल प्रकार शामिल हैं. मुख्य कोशिकाओं को बनाने के 96% स्रावी कोशिकाओं की ग्रंथि, जबकि माध्यमिक कोशिकाओं (एससी) कोशिकाओं के शेष 4% बनाने (के बारे में 80 कोशिकाओं प्रति पुरुष). हालांकि दोनों सेल प्रकार मौलिक तरल पदार्थ के महत्वपूर्ण घटक का उत्पादन, केवल कुछ जीन अनुसूचित जातियों के लिए विशिष्ट होने के लिए जाना जाता है. अनुसूचित जातियों की दुर्लभता, इस प्रकार अब तक, इस महत्वपूर्ण सेल प्रकार के ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण अध्ययन में बाधा आई है। यहाँ, एक विधि है कि आरएनए निष्कर्षण और अनुक्रमण के लिए अनुसूचित जातियों के शुद्धिकरण के लिए अनुमति देता है प्रस्तुत किया है. प्रोटोकॉल एक अनुसूचित जाति विशेष GFP रिपोर्टर व्यक्त मक्खियों से पहले विच्छेदन ग्रंथियों में होते हैं और फिर इन ग्रंथियों protease पाचन और यांत्रिक वियोजन के अधीन करने के लिए अलग-अलग कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए. इन चरणों के बाद, व्यक्ति, रहने वाले, GFP चिह्नित कोशिकाओं आरएनए शुद्धि के लिए एक फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टर (FACS) का उपयोग कर हल कर रहे हैं. इस प्रक्रिया में अनुसूचित जाति-विशिष्ट आरएनए को एक दिन के दौरान डाउनस्ट्रीम आरटी-क्यूपीसीआर और/या आरएनए अनुक्रमण के लिए प्रति शर्त $40 पुरुषों से प्राप्त होता है। तेजी और प्रक्रिया की सादगी कई अलग अलग मक्खियों के transcriptomes के लिए अनुमति देता है, विभिन्न जीनोटाइप या पर्यावरण की स्थिति से, समय की एक छोटी अवधि में निर्धारित किया जा करने के लिए.
Introduction
अंग कई सेल प्रकार के होते हैं, असतत कार्यों के साथ प्रत्येक और कभी कभी जीन के काफी अलग सेट व्यक्त. कैसे एक अंग कार्य करता है की एक सटीक समझ प्राप्त करने के लिए, यह अक्सर इस अंग को बनाता है कि प्रत्येक अलग सेल प्रकार का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. संभव समारोह का पता लगाने के लिए इस्तेमाल प्राथमिक तरीकों में से एक ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण है. इस शक्तिशाली विधि सक्रिय प्रक्रियाओं और रास्ते प्रकट करने के लिए, एक सेल में जीन अभिव्यक्ति का एक स्नैपशॉट प्रदान करता है। हालांकि, विश्लेषण के इस प्रकार अक्सर दुर्लभ सेल आबादी है कि कहीं अधिक प्रचुर पड़ोसी कोशिकाओं से शुद्ध किया जाना चाहिए के लिए मुश्किल है. उदाहरण के लिए, Drosophila पुरुष गौण ग्रंथि एक अंग मुख्य रूप से दो स्रावी सेल प्रकार से बना है. के रूप में दो सेल प्रकार के दुर्लभ इस ग्रंथि की कोशिकाओं का केवल 4% शामिल हैं, एक सेल प्रकार विशिष्ट transcriptome विश्लेषण का उपयोग करने में मदद करने के लिए इन कोशिकाओं के समारोह का निर्धारण नहीं किया गया था.
सहायक ग्रंथियां (एजीएस) कीड़ों में पुरुष प्रजनन पथ के अंग हैं। वे मौलिक तरल पदार्थ (सेमिनल तरल पदार्थ प्रोटीन (एसएफपी) और सहायक ग्रंथि प्रोटीन (एसीपी) के अधिकांश प्रोटीन के उत्पादन के लिए जिम्मेदार हैं। इन SFPs में से कुछ के लिए mated महिलाओं में शारीरिक और व्यवहार प्रतिक्रियाओं प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, आमतौर पर पोस्ट-मैचिंग प्रतिक्रिया (PMR) कहा जाता है. कुछ पीएमआर में शामिल हैं: बढ़ी हुई ओव्यूलेशन और अंडे देने की दर, शुक्राणु का भंडारण और रिहाई, मादा आहार में परिवर्तन, और महिला ग्रहणशीलता में माध्यमिक कोर्टिंग पुरुषों1,2के लिए कमी । के रूप में कीड़े प्रभाव मानव स्वास्थ्य से कई प्रमुख सामाजिक मुद्दों (घातक रोगों के लिए सदिश के रूप में) कृषि के लिए (कीट कीट हो सकता है, अभी तक परागण और मिट्टी की गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण हैं), कीट प्रजनन को समझने के अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है. एजीएस और एजीपी का अध्ययन मॉडल जीव ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टर के साथ काफी उन्नत किया गया है। इन अध्ययनों में ए जी की भूमिका और कुछ व्यक्तिगत प्रोटीनों की भूमिका पर प्रकाश डाला गया है जो वे पीएमआर बनाने में उत्पन्न करते हैं, जो रोग वेक्टर एडीज एजिप्टी3,4, और अन्यकीटों 1 जैसी अन्य प्रजातियों में काम को प्रभावित करते हैं ,5. इसके अलावा, के रूप में AGs मौलिक तरल पदार्थ के घटकों स्रावित1,6 वे अक्सर स्तनधारी प्रोस्टेट ग्रंथि और मौलिक vesicle के कार्यात्मक अनुरूप के रूप में के बारे में सोचा जाता है. इस समारोह समानता दो ऊतक प्रकार के बीच आणविक समानता के साथ संयुक्त, AGs मक्खियों में प्रोस्टेट ग्रंथि के लिए एक मॉडल बना दिया है7.
Drosophila पुरुष के भीतर, सहायक ग्रंथियों के दो पालियों रहे हैं. प्रत्येक पालि एक थैली की तरह एक केंद्रीय लुमेन आसपास स्रावी कोशिकाओं के एक मोनोलेयर से बना संरचना के रूप में देखा जा सकता है, और चिकनी मांसपेशियों द्वारा लिपटे. जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, वहाँ दो रूपात्मक, विकास और कार्यात्मक रूप से अलग स्रावी सेल प्रकार इस ग्रंथि बना रहे हैं: बहुभुज के आकार की मुख्य कोशिकाओं (कोशिकाओं के 96% बनाने), और बड़ा, दौर माध्यमिक कोशिकाओं (एससी) (बनाने ऊपर शेष 4% कोशिकाओं, या प्रति लोब के बारे में 40 कोशिकाओं). यह दिखाया गया है कि दोनों सेल प्रकार के ACPs के अलग सेट का उत्पादन करने के लिए प्रेरित और PMR बनाए रखने. तारीख करने के लिए प्राप्त डेटा के अधिकांश PMR की विशेषता व्यवहार के सबसे ट्रिगर में एक प्रोटीन की भूमिका पर प्रकाश डाला. यह प्रोटीन, सेक्स पेप्टाइड, एक छोटा सा है, 36 एमिनो एसिड पेप्टाइड कि मुख्य कोशिकाओं द्वारा स्रावित होता है8,9,10. हालांकि सेक्स पेप्टाइड PMR में एक प्रमुख भूमिका निभा रहा है, अन्य ACPs, दोनों मुख्य और माध्यमिक कोशिकाओं द्वारा उत्पादित, भी PMR11के विभिन्न पहलुओं को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है ,12,13,14 ,15,16,17. उदाहरण के लिए, हमारे वर्तमान ज्ञान के आधार पर, अनुसूचित जातियों, प्रोटीन वे उत्पादन के माध्यम से, पहले दिन18के बाद एसपी संकेत के स्थायीकरण के लिए आवश्यक प्रतीत होते हैं.
अनुसूचित जातियों की दुर्लभता को देखते हुए (पुरुष प्रति केवल 80 कोशिकाओं), इन कोशिकाओं और प्रोटीन वे उत्पादन के बारे में हमारे सभी ज्ञान आनुवंशिकी और उम्मीदवार दृष्टिकोण से आता है. अब तक, जीनों की केवल एक अपेक्षाकृत छोटी सूची को अनुसूचित जाति-विशिष्ट दिखाया गया है। इस सूची में होमियोडोमेन प्रोटीन दोषपूर्ण सिद्धिका (डीवीई)19, एलएनसीआरए एमएसए20, राब6, 7, 11 और 1921, सीजी 1656 और सीजी 1757511, 15,21 और होमबॉक्स ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर पेट -बी (अब्द-बी)18. पहले, हमने दिखाया है कि अब्द-बी की अभिव्यक्ति और माध्यमिक कोशिकाओं में lncRNA MSA दोनों के लिए उत्परिवर्ती कमी(iab-6cocuD1 उत्परिवर्ती) $ 10 दिनों से केवल एक दिन12 के लिए PMR की लंबाई shortens , 18 , 20. यह फीनोटाइप मादा प्रजनन पथ12,18,20में एसपी के अनुचित भंडारण के कारण प्रतीत होता है . सेलुलर स्तर पर, इस उत्परिवर्ती की माध्यमिक कोशिकाओं असामान्य आकृति विज्ञान दिखाने के लिए, उनकी विशेषता धानी की तरह संरचनाओं को खोने18,20,21. इस उत्परिवर्ती लाइन का उपयोग करना, हम पहले या तो जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती गौण ग्रंथियों12से पूरे AGs के transcriptional प्रोफाइल की तुलना करके अनुसूचित जाति समारोह में शामिल जीन की पहचान करने का प्रयास किया. इसके अलावा, अन्य प्रयोगशालाओं से पता चला कि अनुसूचित जाति संख्या, आकारिकी और धानी की मात्रा पुरुष आहार, संभोग की स्थिति और उम्र21,25,26पर निर्भर करती है.
हालांकि सकारात्मक प्रगति इन दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था, एक पूर्ण अनुसूचित जाति transcriptome हासिल से दूर था. इस अंग में इन कोशिकाओं की दुर्लभता ने जंगली प्रकार की कोशिकाओं से भी आगे बढ़ने में कठिनाई का कारण बनाया। जीन अभिव्यक्ति के परीक्षण के लिए, विशेष रूप से पर्यावरण उत्तेजनाओं के बाद इन कोशिकाओं में परिवर्तन भी कठिन होगा. इस प्रकार, अनुसूचित जाति आरएनए को अलग और शुद्ध करने के लिए एक विधि जो विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि और पर्यावरणीय स्थितियों के तहत प्रदर्शन करने के लिए काफी तेज और सरल थी।
अब्द-बी और एमएसए दोनों जीनों को अनुसूचित जातियों में अपनी अभिव्यक्ति के लिए ड्रोसोफिला बिटोरैक्स परिसर(जिसे डी1 बढ़ाने कहा जाता है ) से एक विशिष्ट 1.1 केबी बढ़ाने की आवश्यकता होती है। इस enhancer पहले एक GAL4 ड्राइवर बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि, जब एक UAS-GFPके साथ संबद्ध, विशेष रूप से अनुसूचित जातियों में मजबूत GFP अभिव्यक्ति ड्राइव करने में सक्षम है. इस प्रकार, हम दोनों जंगली प्रकार और iab-6cocuD1 AGs से इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक FACS प्रोटोकॉल के लिए आधार के रूप में इस लाइन का इस्तेमाल किया. iab-6cocuD1 उत्परिवर्ती अनुसूचित जाति के रूप में एक अलग सेलुलर आकारिकी प्रदर्शित करते हैं, हम बताते हैं कि इस प्रोटोकॉल काफी अलग परिस्थितियों में इस दुर्लभ सेल प्रकार से उनके transcriptome के निर्धारण के लिए कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
द्रोसोफिला ऊतक जैसे कल्पनात्मक डिस्क से कोशिका वियोजन के तरीके पहले से ही23वर्णित हैं . गौण ग्रंथियों पर इन प्रक्रियाओं का उपयोग करने के हमारे प्रयास विफल रहे, हमें इस नए प्रोटोकॉल को विकसि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Karch प्रयोगशाला के सदस्यों के लिए आभारी हैं, iGE3 जीनोमिक्स प्लेटफॉर्म करने के लिए, जिनेवा विश्वविद्यालय के प्रवाह Cytometry कोर सुविधा के लिए, और डॉ जीन Pierre Aubry-Lachainaye जो FACS के लिए प्रोटोकॉल सेट करने के लिए. हम IGV पर पढ़ता visualizing के साथ उसकी मदद के लिए Luca Stickley धन्यवाद. हम आंकड़ों का पुन: उपयोग करने के लिए कोमल अनुमति के लिए खुद को धन्यवाद, और संपादकों हमें लेखन के साथ रचनात्मक होने के लिए प्रेरित करने के लिए.
इस अनुसंधान जिनेवा के राज्य (सीआई, आरकेएम, FK), अनुसंधान के लिए स्विस राष्ट्रीय कोष (www.snf.ch) (FK और RKM) और Claraz फाउंडेशन (FK) से दान द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μl graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μl bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
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