ショウジョウバエ男性アクセサリー腺の二次細胞からRNAを分離するFACSベースのプロトコル
Summary
ここでは、RNAシーケンシングおよびRT-qPCRに対するショウジョウバエ男性アクセサリー腺(二次細胞)から特定の細胞集団を解離し、ソートするプロトコルを提示する。細胞分離は、解剖、プロテアーゼ消化および機械的分散を必要とする多段階解離プロセス後のGFP発現二次細胞のFACS精製によって達成される。
Abstract
臓器の機能を理解するために、多くの場合、その構成細胞集団の役割を理解することが有用である。残念ながら、個々の細胞集団の希少性は、多くの場合、分子研究のための十分な材料を得ることを困難にします。例えば、ショウジョウバエ男性生殖系の付属腺には、2つの異なる分泌細胞タイプが含まれています。主細胞は腺の分泌細胞の96%を占め、二次細胞(SC)は残りの4%の細胞(雄あたり約80細胞)を構成する。両方の細胞型は精液の重要な成分を産生するが、SCに特異的であることが知られている遺伝子はごくわずかである。SCの希少性は、これまでのところ、この重要な細胞型のトランスクリプトーミクス解析研究を妨げている。ここでは、RNA抽出及びシーケンシングのためのSCの精製を可能にする方法を提示する。プロトコルは、最初にSC特異的GFPレポーターを発現するハエから腺を解剖し、次にこれらの腺をプロテアーゼ消化と機械的解離にさらして個々の細胞を得ることで構成される。これらのステップに続いて、個体、生きている、GFPマーク付き細胞は、RNA精製のための蛍光活性化細胞選別機(FACS)を用いてソートされる。この手順では、1日の間に下流RT-qPCRおよび/またはRNAシーケンシングの条件ごとに約40人の男性からSC特異的RNAが得られます。手順の迅速性と簡易性は、異なる種型または環境条件から、多くの異なるハエのトランスクリプトームを短期間で決定することを可能にします。
Introduction
臓器は複数の細胞型で構成され、それぞれが個別の機能を持ち、時には非常に異なる遺伝子のセットを発現します。臓器がどのように機能するかを正確に理解するためには、この臓器を構成するそれぞれの異なる細胞型を研究することがしばしば重要です。可能な機能を探索するために使用される主な方法の 1 つは、トランスクリプトーム分析です。この強力な方法は、細胞内の遺伝子発現のスナップショットを提供し、活性プロセスおよび経路を明らかにする。しかし、この種の分析は、はるかに豊富な隣接細胞から精製しなければならない希少な細胞集団では、しばしば困難である。例えば、ショウジョウバエ男性アクセサリー腺は、主に2つの分泌細胞型からなる器官である。2つの細胞タイプの稀な部分は、この腺の細胞のわずか4%を含むので、細胞型特異的トランスクリプトーム分析の使用は、これらの細胞の機能を決定するのに役立たなかった。
アクセサリー腺(AG)は、昆虫の男性の生殖管の器官です。彼らは精液(精液タンパク質(SGP)および付属腺タンパク質(AAP)のほとんどのタンパク質の生産を担当しています。これらのSAFPのいくつかは、交尾雌における生理的および行動的応答を誘発することが知られており、一般に交尾後応答(PMR)と呼ばれる。一部のPMRには、排卵および卵子産卵率の増加、精子の貯蔵および放出、女性の食事療法の変化、および二次求動男性1、2に対する女性受容性の低下が含まれる。昆虫は人間の健康(致命的な病気のベクターとして)から農業(昆虫は害虫でありながら、受粉や土壌の質にとって重要である)に至る多くの主要な社会的問題に影響を与えるので、昆虫の繁殖を理解することは研究の重要な領域です。AGとAGPの研究は、モデル生物のショウジョウバエメラノガスターで大幅に進められている。これらの研究は、AGと彼らがPMRを作成する際に生成する個々のタンパク質の一部の役割を強調し、疾患ベクターAedes aegypti3、4、および他の昆虫1のような他の種の研究に影響を与えました1 、5.さらに、AGが精液1、6の成分を分泌するように、それらはしばしば哺乳動物前立腺および精液胞の機能的類似体と考えられている。この機能の類似性は、2つの組織型間の分子類似性と組み合わされ、AGをハエ7における前立腺のモデルにした。
ショウジョウバエの男性の中には、アクセサリー腺の2つの葉があります。各葉は、中央のルーメンを取り囲む分泌細胞の単層で構成され、平滑筋で包まれた嚢状の構造として見ることができます。前述のように、この腺を構成する形態学的、発達的および機能的に明確な分泌細胞タイプの2つがあります:多角形形の主細胞(細胞の約96%を構成する)と、より大きな円形の二次細胞(SC)(残りの4%の細胞、またはローブあたり約40細胞)。両方の細胞型がPMRを誘導および維持するためにAAPの異なるセットを作り出すことが示されている。現在までに得られたデータのほとんどは、PMRの特徴的な挙動のほとんどを引き起こす単一のタンパク質の役割を強調しています。このタンパク質は、性ペプチド、主細胞8、9、10によって分泌される小さい、36アミノ酸ペプチドである。性ペプチドはPMRに大きな役割を果たしているように見えるが、主細胞と二次細胞の両方によって産生される他のAPCは、PMR11、12、13、14の様々な側面に影響を与えることも示されている。 ,15,16,17.例えば、我々の現在の知識に基づいて、SCは、それらが産生するタンパク質を介して、最初の18日後のSPシグナル伝達の永続化のために必要とされる。
SCの希少性(男性1人につきわずか80細胞)を考えると、これらの細胞とそれらが産生するタンパク質に関するすべての知識は、遺伝学と候補アプローチから来ています。これまでのところ、比較的小さな遺伝子のリストのみがSC特異的であることが示されている。このリストには、ホメオドメインタンパク質欠陥証明(Dve)19、lncRNA MSA20、Rab6、7、11および1921、CG1656およびCG17575 11、および含まれる。 15,21およびホキオーボックス転写因子腹部 B (Abd-B)18.以前に、二次細胞におけるAbd-BおよびlncRNA MSAの発現に対する変異欠損(iab-6cocuD1変異体)は、PMRの長さを〜10日から1日12日に短縮することを示した。,18歳,20.この表現型は、女性の生殖管12、18、20におけるSPの不適切な貯蔵によって引き起こされるようです。細胞レベルでは、この変異体の二次細胞は異常な形態を示し、その特徴的な真空様構造18、20、21を失う。この変異線を用いて、以前に野生型または変異型アクセサリー腺12から全AGの転写プロファイルを比較することにより、SC機能に関与する遺伝子を同定しようと試みた。また、他の研究室は、SC番号、形態および真空含有量が男性の食事、交配状態および年齢21、25、26に依存することを示した。
これらのアプローチを用いて肯定的な進歩がなされたが、完全なSCトランスクリプトームは達成にはほど遠かった。この器官のこれらの細胞の希少性は、野生型細胞からさらに進歩することを困難にしました。遺伝子発現をテストするために、特定の環境刺激後のこれらの細胞の変化はさらに困難であろう。したがって、異なる遺伝的背景や環境条件下で実行するのに十分な速く、簡単なSC RNAを分離および精製する方法が必要でした。
Abd-BおよびMSA遺伝子の両方は、SC18、20における発現のために、ショウジョウバエビオラビホラックスコンプレックス(D1エンハンサーと呼ばれる)からの特定の1.1 kbエンハンサーを必要とする。このエンハンサーは、以前にUAS-GFPに関連付けられている場合、特にSCで強力なGFP式を駆動することができるGAL4ドライバを作成するために使用されてきました。したがって、この行を FACS プロトコルの基礎として使用して、これらの細胞を野生型とiab-6cocuD1 AG の両方から分離します。iab-6cocuD1変異型SCは異なる細胞形態を示すので、このプロトコルは、非常に異なる条件下でこの希少細胞型から転写物の決定のために細胞を単離するために使用できることを示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
虚円盤のようなショウジョウバエ組織からの細胞解離の方法については、既に23について説明されている。単にアクセサリー腺でこれらの手順を使用する試みは失敗し、この新しいプロトコルを開発することを奨励しました。プロテアーゼ消化と機械的トリチュアーションは、手順の成功に向けてトラブルショットを打つ重要なステップであり、実験者が満足のいく?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、カルチ研究室のメンバー、iGE3ゲノミクスプレートフォーム、ジュネーブ大学のフローサイトメトリーコア施設、およびFACSのプロトコルを設定したジャン=ピエール・オーブリー・ラチャナエ博士に感謝しています。私たちは、IGV上の読み取りを視覚化する彼の助けのためにルカスティックリーに感謝します。フィギュアを再利用する優しい許可を与えてくださったことに感謝し、編集者の皆さんから、書き込みをクリエイティブにするよう促してくれました。
この研究は、ジュネーブ州(CI、RKM、FK)、スイス国立研究基金(www.snf.ch)(FKとRKM)、クララズ財団(FK)からの寄付によって資金提供されました。
Materials
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μl graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μl bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
- Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
- League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
- Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
- Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
- Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
- Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
- Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).
- Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. 유전학. 202 (3), 1029-1041 (2016).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
- Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
- Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
- Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
- Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).
- Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).
- Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).
- Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
- Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
- Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
- Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335 (2019).
