Ett FACS-baserat protokoll för att isolera RNA från de sekundära cellerna i Drosophila manliga tillbehörs körtlar
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att separera och sortera en specifik cellpopulation från Drosophila manliga tillbehörs körtlar (sekundära celler) för RNA-SEKVENSERING och RT-qPCR. Cell isolering åstadkoms genom FACS rening av GFP-uttrycker sekundära celler efter en multistep-dissociation process som kräver dissektion, proteaser matsmältning och mekanisk dispersion.
Abstract
För att förstå funktionen hos ett organ, är det ofta bra att förstå den roll som dess konstituerande cellpopulationer. Tyvärr, den sällsynthet enskilda cellpopulationer gör ofta det svårt att få tillräckligt med material för molekylära studier. Till exempel, tillbehöret körtel i Drosophila manliga reproduktionssystemet innehåller två distinkta sekretoriska celltyper. De viktigaste cellerna utgör 96% av de sekretoriska cellerna i körteln, medan de sekundära cellerna (SC) utgör resterande 4% av cellerna (om 80 celler per hane). Även om båda celltyperna producerar viktiga komponenter i säden vätskan, är det bara några få gener som är kända för att vara specifika för SCs. Den sällsynthet SCs har hittills hindrat transcriptomic analys studie av denna viktiga celltyp. Här presenteras en metod som möjliggör rening av SCs för RNA-extraktion och sekvensering. Protokollet består i första dissekera körtlar från flugor som uttrycker en SC-specifik GFP reporter och sedan utsätta dessa körtlar till proteas matsmältning och mekanisk dissociation att få enskilda celler. Efter dessa steg sorteras enskilda, levande, GFP-märkta celler med hjälp av en fluorescerande aktiverad cell sorterare (FACS) för RNA-rening. Denna procedur ger SC-specifika RNAs från ~ 40 hanar per villkor för nedströms RT-qPCR och/eller RNA-sekvensering under loppet av en dag. Den snabbhet och enkelhet i förfarandet möjliggör transkriptom av många olika flugor, från olika genotyper eller miljöförhållanden, som skall bestämmas på kort tid.
Introduction
Organ består av flera celltyper, var och en med diskreta funktioner och ibland uttrycker väldigt olika uppsättningar av gener. För att få en exakt förståelse för hur ett organ fungerar, är det ofta kritiskt att studera varje distinkt celltyp som utgör detta organ. En av de primära metoder som används för att utforska möjlig funktion är transkriptome analys. Denna kraftfulla metod ger en ögonblicksbild av genuttrycket i en cell, för att avslöja aktiva processer och vägar. Emellertid, denna typ av analys är ofta svårt för sällsynta cellpopulationer som måste renas från mycket mer-riklig angränsande celler. Till exempel är Drosophila manliga tillbehörs körtel ett organ som består främst av två sekretoriska celltyper. Eftersom ovanligare av de två celltyperna består av endast 4% av cellerna i denna körtel, användning av en cell-typ specifik transkriptome analys hade inte använts för att avgöra funktionen av dessa celler.
Tillbehörs körtlar (AGs) är organ i de manliga reproduktionsorganen i insekter. De är ansvariga för produktionen av mest av proteinerna av den nyskapande vätskan (seminalvätskeproteiner (sfps) och tillbehör körtel proteiner (acps)). Några av dessa SFPs är kända för att inducera fysiologiska och beteendemässiga svar hos parade honor, vanligen kallad efter parning svar (PMR). Några av de PMRS inkluderar: en ökad ägglossning och äggläggning hastighet, lagring och frisättning av spermier, en förändring i kvinnlig kost, och en minskning av kvinnlig mottaglighet för sekundär uppvaktning män1,2. Som insekter påverkar många stora samhälleliga frågor från människors hälsa (som vektorer för dödliga sjukdomar) till jordbruket (insekter kan vara skadedjur, men är kritiska för pollinering och markens kvalitet), förstå insekt reproduktion är ett viktigt forskningsområde. Studiet av AGs och ACPs har avancerat betydligt med modellorganismen Drosophila melanogaster. Dessa studier har belyst den roll som AGS och några av de enskilda proteiner som de producerar för att skapa PMR, påverkar arbetet i andra arter som sjukdomen vektor Aedes aegypti3,4, och andra insekter1 ,5. Dessutom, som AGS utsöndrar beståndsdelarna i sädesvätskan1,6 de är ofta betraktas som funktionell analog av däggdjur prostatakörteln och sädesvesikel. Denna funktion likhet i kombination med molekylära likheter mellan de två vävnads-typer, har gjort AGs en modell för prostatakörteln i flugor7.
Inom Drosophila manliga, det finns två lober av tillbehör körtlar. Varje lob kan ses som en SAC-liknande struktur som består av en enskiktslager av sekretoriska celler som omger en central lumen, och insvept av glatt muskulaturen. Som nämnts ovan, det finns två morfologiskt, utvecklingsstörda och funktionellt distinkta sekretoriska celltyper som utgör denna körtel: den månghörniga-formade huvud celler (som utgör ~ 96% av cellerna), och de större, runda sekundära celler (SC) (som utgör resterande 4% av cellerna, eller cirka 40 celler per LOB). Det har visats att båda celltyperna producerar distinkta uppsättningar av ACPs för att inducera och bibehålla PMR. De flesta av de uppgifter som erhållits hittills belysa rollen av ett enda protein i utlöser de flesta av de karakteristiska beteenden av PMR. Detta protein, kön peptid, är en liten, 36 Amino Acid peptid som utsöndras av de viktigaste cellerna8,9,10. Även om kön peptid verkar spela en viktig roll i PMR, andra acps, som produceras av både de viktigaste och sekundära celler, har också visat sig påverka olika aspekter av PMR11,12,13,14 ,15,16,17. Till exempel, baserat på vår nuvarande kunskap, SCs, via de proteiner som de producerar, verkar krävas för förevigning av SP signalering efter den första dagen18.
Med tanke på den sällsynthet SCs (endast 80 celler per hane), all vår kunskap om dessa celler och de proteiner som de producerar kommer från genetik och kandidat strategier. Hittills har endast en relativt liten lista över gener visats vara SC-specifik. Denna förteckning omfattar homeodomain protein defekt proventriculus (DVE)19, den lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 och 1921, CG1656 och CG1757511, 15,21 och Hedgehog transkription faktorn buk-b (Abd-b)18. Tidigare har vi visat att en mutant bristfällig för både uttrycket av Abd-B och lncRNA MSA i sekundära celler (IAB-6cocuD1 Mutant) förkortar längden på PMR från ~ 10 dagar till endast en dag12 , 18 , 20. denna fenotyp verkar bero på felaktig lagring av SP i reproduktionsorganen i honor12,18,20. På cellnivå, de sekundära cellerna i denna Mutant uppvisar onormal morfologi, förlorar sin karakteristiska vacuole-liknande strukturer18,20,21. Med denna Mutant linje, vi försökte tidigare att identifiera gener inblandade i SC funktion genom att jämföra transkriptionella profiler av hela AGs från antingen Wild Type eller mutant tillbehör körtlar12. Också, andra laboratorier visade att SC-nummer, morfologi och vakuolär innehåll beror på manlig diet, parnings status och ålder21,25,26.
Även om positiva framsteg gjordes med dessa metoder, en fullständig SC transkriptome var långt ifrån uppnåtts. Den rvinklighet av dessa celler i detta organ gjorde det svårt att utvecklas ytterligare även från vilda typ celler. För att testa genuttryck, förändringar i dessa celler efter särskilda miljömässiga stimuli skulle vara ännu svårare. Således behövdes en metod för att isolera och renodla SC-RNA som var snabbt och enkelt nog att prestera under olika genetiska bakgrunder och miljöförhållanden.
Både Abd-B och MSA gener kräver en specifik 1,1 KB förstärkare från Drosophila bithorax Complex (kallas D1 Enhancer) för deras uttryck i SCs18,20. Denna förstärkare har tidigare använts för att skapa en GAL4 drivrutin som, när den är associerad med en UAS-GFP, kan köra starka GFP uttryck specifikt i SCs. Således använde vi denna linje som grund för ett FACS-protokoll för att isolera dessa celler från både vildtyp och IAB-6cocuD1 AGS). Som IAB-6CocuD1 Mutant SCs Visa en annan cellulär morfologi, visar vi att detta protokoll kan användas för att isolera celler för bestämning av deras transkriptome från denna sällsynta celltyp under väldigt olika förhållanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoder för cell dissociation från Drosophila vävnad som imaginal skivor är redan beskrivna23. Våra försök att helt enkelt använda dessa förfaranden på tillbehör körtlar misslyckats, uppmuntra oss att utveckla detta nya protokoll. Proteas matsmältning och mekanisk sönderdelning var kritiska steg vi Felsökte för framgången av förfarandet, och vi placerade därför många anteckningar i avsnitten 2 till 5 för att hjälpa experimenterare att få tillfredsställande resulta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma mot medlemmarna i Karch Lab, till iGE3 Genomics plateform, till Flow Cytometry Core Facility vid universitetet i Genève, och till Dr Jean-Pierre Aubry-Lachainaye som sätter protokollet för FACS. Vi tackar Luca Stickley för hans hjälp med att visualisera läsningar på IGV. Vi tackar oss för ett skonsamt tillstånd att återanvända siffror och redaktörerna för att vi ska vara kreativa med att skriva.
Denna forskning finansierades av staten Genève (CI, RKM, FK), den schweiziska nationella fonden för forskning (www.snf.ch) (FK och RKM) och donationer från Claraz Foundation (FK).
Materials
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μl graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μl bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
- Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
- League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
- Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
- Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
- Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
- Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
- Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).
- Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. 유전학. 202 (3), 1029-1041 (2016).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
- Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
- Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
- Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
- Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).
- Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).
- Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).
- Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
- Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
- Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
- Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335 (2019).
