Visualisera Astrocytmorfologi med Lucifer gula Jontofores
Summary
Astrocyter är morfologiskt komplexa celler, exemplifieras av deras flera processer och buskiga territorier. För att analysera deras utarbetade morfologi presenterar vi ett tillförlitligt protokoll för att utföra intracellulära Lucifer gula Jontofores i lätt fixerad vävnad.
Abstract
Astrocyter är viktiga komponenter i neurala kretsar. De kakel hela centralanervsystemet (CNS) och är involverade i en mängd olika funktioner, som inkluderar signalsubstansen clearance, Jon reglering, synaptisk modulering, metabola stöd till nervceller, och blod flödesreglering. Astrocyter är komplexa celler som har en Soma, flera stora grenar, och många fina processer som kontaktar olika cellulära element inom neuropil. För att bedöma morfologin av astrocyter, är det nödvändigt att ha en tillförlitlig och reproducerbar metod för att visualisera deras struktur. Vi rapporterar ett tillförlitligt protokoll för att utföra intracellulär Jontofores av astrocyter med fluorescerande Lucifer gul (LY) färgämne i lätt fast hjärnvävnad från vuxna möss. Denna metod har flera funktioner som är användbara för att karakterisera astrocytmorfologi. Det möjliggör tredimensionell rekonstruktion av enskilda astrocyter, vilket är användbart för att utföra morfologiska analyser på olika aspekter av deras struktur. Immunohistokemi tillsammans med LY iontofores kan också utnyttjas för att förstå samspelet mellan astrocyter med olika komponenter i nervsystemet och för att utvärdera uttrycket av proteiner inom de märkta astrocyterna. Detta protokoll kan genomföras i en mängd olika musmodeller av CNS-störningar för att rigoröst undersöka astrocytmorfologi med ljus mikroskopi. LY iontofores ger en experimentell metod för att utvärdera astrocytstruktur, särskilt i samband med skada eller sjukdom där dessa celler föreslås genomgå betydande morfologiska förändringar.
Introduction
Astrocyter är de vanligast förekommande gliaccellerna i centralanervsystemet (CNS). De spelar roller i Ion homeostas, blod flödesreglering, synapsen bildas samt eliminering, och signalsubstansen upptag1. Det breda utbudet av astrocytfunktioner återspeglas i deras komplexa morfologiska struktur2,3. Astrocyter innehåller flera primära och sekundära grenar som delas in i tusentals finare grenarna och broschyrer som direkt interagerar med synapser, dendriter, axoner, blodkärl, och andra gliaceller. Astrocytmorfologi varierar mellan olika hjärnregioner, vilket kan antyda deras förmåga att utföra sina funktioner differentially i neuronala kretsar4. Dessutom, astrocyter är kända för att förändra sin morfologi under utveckling, under fysiologiska förhållanden, och i flera sjukdomstillstånd3,5,6.
En konsekvent, reproducerbar metod behövs för att korrekt lösa komplexiteten i astrocytmorfologin. Traditionellt, immunohistokemi har använts för att visualisera astrocyter med användning av astrocytspecifika eller astrocytberikade protein markörer. Emellertid, dessa metoder avslöjar mönstret av proteinuttryck snarare än strukturen av astrocyt. De vanligen använda markörer, såsom gliaceller hjärn sura protein (gfap) och S100 kalcium bindning protein β (S100β), inte uttrycker i hela cell volymen och därmed inte lösa fullständig morfologi7. Genetiska metoder för att uttrycka fluorescerande proteiner ubiquitously i astrocyter (virala injektioner eller transgena mus reporter linjer) kan identifiera de finare grenar och övergripande territorium. Det är dock svårt att skilja enskilda astrocyter, och analyser kan vara partiska av den astrocytpopulation som riktas mot den specifika promotorn8. Seriell sektion elektronmikroskopi har använts för att avslöja en detaljerad bild av samspelet mellan astrocytprocesserna med synapser. På grund av de tusentals astrocytprocesserna som kontaktar synapser är det för närvarande inte möjligt att rekonstruera en hel cell med denna teknik9, även om detta förväntas förändras med hjälp av maskininlärningsmetoder för dataanalys.
I denna rapport fokuserar vi på ett förfarande för att karakterisera mus astrocyter med hjälp av intracellulär Jontofores med Lucifer gult (LY) färgämne, med hjälp av CA1 stratum radiatum som ett exempel. Metoden bygger på banbrytande tidigare verk av Eric Bushong och mark Ellisman10,11. Astrocyter från lätt fasta hjärn skivor identifieras genom sin distinkta Soma form och fylls med LY. Cellerna är sedan avbildas med konfokalmikroskopi. Vi visar hur enkelt Jontofores kan användas för att rekonstruera enskilda astrocyter och utföra detaljerade morfologiska analyser av deras processer och territorium. Också, denna metod kan tillämpas i samband med immunohistokemi att identifiera rumsliga relationer och interaktioner mellan astrocyter och nervceller, andra gliaceller och hjärn vaskulatur. Vi anser ly Jontofores vara ett mycket lämpligt verktyg för att analysera morfologi i olika hjärnregioner och musmodeller av friska eller sjukdomstillstånd7,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metod som beskrivs i detta dokument beskriver ett sätt att visualisera astrocytmorfologi med hjälp av intracellulära Jontofores av LY Dye i lätt fasta hjärn skivor. Det finns flera viktiga faktorer som lyfts fram i detta protokoll som bidrar till framgångsrik jonitofores och morfologisk rekonstruktion av cellerna. En faktor är kvaliteten och reproducerbarheten av bilderna, som bestäms till stor del av en ålder av musen och resultatet av perfusion. I denna studie använde vi C57/BL6N möss 6 − 8 veckor gaml…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar MS Soto, Dr Yu, och Dr Octeau för vägledning samt kommentarer till texten. Detta arbete stöds av NS060677.
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
References
- Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
- Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
- Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
- Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
- Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
- Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
- Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
- Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
- Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. 신경과학. 113 (1), 221-233 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
- Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
- Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
- Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
- Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
- Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
- Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
- Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).
