Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi
Summary
Burada, organellerin hücre içi naklini ve murine astrositlerinde plazma membran proteinlerinin ticaretini görselleştirmek için in vitro canlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol aynı zamanda kargo taşımacılığı güzergahları ve kinetik belirlemek için bir görüntü analizi metodolojisi sunar.
Abstract
Astrositler yetişkin beyninde en bol hücre tipleri arasında yer alır, onlar fonksiyonların çokluğu önemli rol oynarlar. Beyin homeostaz merkezi bir oyuncu olarak, astrositler hayati metabolitleri ve tampon ekstrasellüler su, iyonlar ve glutamat ile nöronkaynağı. “Üçlü” sinapsayrılmaz bir bileşeni olan astrositler, sinapsların oluşumunda, budamasında, bakımında ve modülasyonunda da önemlidir. Bu son derece etkileşimli fonksiyonları etkinleştirmek için, astrositler kendi aralarında ve diğer glial hücreler, nöronlar, beyin vaskülatürü ve hücre dışı çevre ile hücre içeren özel membran proteinleri çok sayıda iletişim yapışma molekülleri, aquaporinler, iyon kanalları, nörotransmitter taşıyıcılar ve boşluk bağlantı molekülleri. Bu dinamik akı desteklemek için, astrositler, nöronlar gibi, sıkı koordine ve verimli hücre içi taşıma güveniyor. Hücre içi ticaretin yaygın olarak açıklandığı nöronların aksine, astrositlerde mikrotübül bazlı ulaşım daha az çalışılmıştır. Bununla birlikte, hücre zarı proteinlerinin ekolog ve endositik ticareti ve hücre içi organel nakli astrositlerin normal biyolojisini düzenler ve bu süreçler genellikle hastalıktan veya yaralanmaya yanıt olarak etkilenir. Burada kültür yüksek kaliteli murine astrositler için basit bir protokol savuruyoruz, floresan astrositik proteinleri ve organelleri ilgi çekici olarak etiketlemek ve zaman atlamalı konfokal mikroskopi kullanarak hücre içi aktarım dinamiklerini kaydetmek için. Ayrıca, mevcut görüntü analiz yazılımlarını (imageJ/FIJI) eklentilerini kullanarak edinilen filmlerden ilgili taşıma parametrelerinin nasıl ayıklanıp ölçültüldünü de gösteriyoruz.
Introduction
Astrositler yetişkin merkezi sinir sisteminde en bol hücrelerdir, onlar benzersiz gelişimsel ve homeostatik fonksiyonları gerçekleştirmeknerede 1. Astrositler, nörotransmitter reseptörleri, taşıyıcılar ve sinaps oluşumunu kolaylaştıran hücre adezyon moleküllerini içeren üçlü sinapsların bir parçası olarak pre-ve postsinaptik terminallerle doğrudan temas yoluyla sinaptik gelişimi modüle eder. ve nöron-astrosit iletişimi2. Buna ek olarak, astrositler sinaptik iletimi aktif olarak kontrol eder ve sinaptik yarıktan çıkarıcı nörotransmitterleri hızla çıkararak nöronal eksitotoksisiteyi önler, nörotransmitterleri geri dönüştürer ve sinaptik budama dakatılır3 , 4.2.2 , 5.000 , 6. Bu son derece etkileşimli fonksiyonları etkinleştirmek için, astrositler kendi aralarında iletişim kurmak, diğer glial hücreleri ile, ve özel membran proteinleri aracılığıyla nöronlar ile, hücre adezyon molekülleri de dahil olmak üzere, aquaporins, iyon kanalları, nörotransmitter taşıyıcılar ve boşluk kavşak molekülleri. Astrositler, hücre içi ve hücre dışı ortamlarındaki dalgalanmalara yanıt olarak buproteinlerin yüzey düzeylerini aktif olarak değiştirirler 7. Ayrıca, astrosit fonksiyonu için gerekli olan mitokondri, lipid damlacıkları ve bozunatif ve geri dönüşüm organellerinin seviyelerinde ve dağılımındaki değişiklikler enerji arzını, metabolit kullanılabilirliğini ve hücresel temizleme süreçlerini modüle eder ve Hayatta kalma.
Membran protein ve organel ticareti ve astrositlerde konumlandırma dinamik değişiklikler motor proteinlerve adaptörlerin uyumlu fonksiyonu ile kolaylaştırılır kargo hareketliliği teşvik8,9. Benzer şekilde, membran proteinlerinin yüzey seviyeleri içselleştirme ve geri dönüşüm olayları ile modüle edilir10. Bu kargolar aktin, mikrotübüller ve muhtemelen ara filamentler parça karmaşık bir ağ üzerinden taşınır8. Büyüyen mikrotübül artı uçlarında biriken son bağlayıcı protein 1’in (EB1) immünororesans boyamasını temel alan çalışmalar, mikrotübüllerin astrosit demetlerinde perinükleustan dışarı yayılarak artı uçlarını çevre11. Ancak, canlı hücre görüntüleme kullanarak mikrotübüller ve diğer sitoskeletal elementlerin organizasyon ve polarite kapsamlı bir inceleme hala eksiktir. Organellerin ve membran proteinlerinin dinamiğinin altında yatan mekanizmaların çoğu nöronlarda ve diğer hücre tiplerinde kapsamlı bir şekilde incelenmekle birlikte, astrositlerde kargo hareketliliği daha az anlaşılmaktadır. Astrositlerde protein ve organel dağılımındaki değişiklikler hakkındaki mevcut bilgilerimizin çoğu, kargo dinamiklerinin hassas mekansal ve zamansal incelemesini engelleyen sabit preparatın geleneksel antikor bazlı etiketlemesini temel alıyor7, 12. Yıl.
Burada, yüksek saflıkta birincil fare astrosit kültürlerinde canlı görüntüleme için membran proteinleri ve organelleri etiketlemek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokolü kullanarak, transfekte astrositlerde yeşil floresan proteinin (GFP) etiketli membran proteinlerinin dinamik lokalizasyonunu izlediğimiz, gap kavşak proteinconnexin 43 (Cx43-GFP) ve uyarıcı amino asit dahil olmak üzere örnekler salıyoruz. taşıyıcı 1 (EAAT1-GFP). Ayrıca asidik organelleri görselleştirmek ve canlı astrositlerde insan ticareti dinamiklerini takip etmek için floresan asiotropik prob kullanımını da tanımlıyoruz. Son olarak, tek tek kargolar için taşıma parametrelerini ayıklamak ve değerlendirmek için hızlandırılmış verilerin nasıl analiz edilebildiğini gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, yüksek saflıkta birincil fare kortikal MD astrositlerinde hızlandırılmış video mikroskobu kullanarak floresan etiketli organelleri ve membran proteinlerini ifade etmek, görselleştirmek ve izlemek için deneysel bir yaklaşımı tanımlıyoruz. Ayrıca parçacık dinamiklerini ölçmek için bir metodoloji anahat. Birincil astrositlerde protein ve organel dinamiğinin doğrudan görselleştirilmesi, bu hücrelerde hücre içi taşımanın düzenlenmesini in vitro olarak incelemek için güçlü bir araç …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DNL, Kuzey Carolina Üniversitesi tarafından Chapel Hill (UNC) Tıp Fakültesi’nde Simmons Bursu ile desteklenmiştir. TWR UNC PREP Grant R25 GM089569 tarafından desteklenmiştir. UNC Nörobilim Merkezi Mikroskobu Çekirdek Tesisi’ni kullanan çalışmalar kısmen NIH-NINDS Nörobilim Merkezi Destek Desteği P30 NS045892 ve NIH-NICHD Entelektüel ve Gelişimsel Engelliler Araştırma Merkezi Destek Destek U54 tarafından desteklendi. HD079124.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
| Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
| Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
| Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
| Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
| Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
| Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
| Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
| Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
| Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).
- Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).
- Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).
- Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).
- Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).
- Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61 (6), 917-928 (2013).
- Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60 (4), 594-604 (2012).
- Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).
- Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).
- Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152 (3), 479-491 (2013).
- . IJ KymoToolBox Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016)
