Drosophila melanogaster में रक्त मस्तिष्क बैरियर अखंडता के लिए परख
Summary
रक्त मस्तिष्क बाधा अखंडता तंत्रिका तंत्र समारोह के लिए महत्वपूर्ण है. Drosophila मेलेनोगैस्टरमें, रक्त मस्तिष्क बाधा देर भ्रूणजनन के दौरान glial कोशिकाओं द्वारा बनाई गई है। इस प्रोटोकॉल डी मेलेनोगैस्टर भ्रूण और तीसरे instar लार्वा में रक्त मस्तिष्क बाधा गठन और रखरखाव के लिए परख के लिए तरीकों का वर्णन करता है।
Abstract
उचित तंत्रिका तंत्र के विकास में रक्त मस्तिष्क बाधा का गठन, प्रसार बाधा शामिल है जो तंत्रिका तंत्र तक पहुंच को कसकर नियंत्रित करता है और विषाक्त पदार्थों और रोगजनकों से तंत्रिका ऊतक की रक्षा करता है। इस बाधा के गठन में दोष neuropathies के साथ सहसंबद्ध किया गया है, और इस बाधा के टूटने कई neurodegenerative रोगों में देखा गया है. इसलिए, संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए रक्त-मस्तिष्क बाधा के गठन और रखरखाव को विनियमित करने वाले जीनों की पहचान करना महत्वपूर्ण है। आदेश में सटीक भूमिकाओं को समझने के लिए इन जीन तंत्रिका विकास में खेलते हैं, यह रक्त मस्तिष्क बाधा की अखंडता पर बदल जीन अभिव्यक्ति के प्रभाव परख करने के लिए आवश्यक है. रक्त मस्तिष्क बाधा की स्थापना में कार्य करने वाले कई अणुओं को यूकैरियोटिक प्रजातियों में संरक्षित पाया गया है, जिसमें फल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टरशामिल हैं। फल मक्खियों तंत्रिका तंत्र के विकास और समारोह को विनियमित आणविक तंत्र की जांच के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली साबित हो गया है. इस प्रोटोकॉल डी मेलेनोगैस्टर विकास के भ्रूण और लार्वा चरणों के दौरान रक्त मस्तिष्क बाधा अखंडता के लिए परख के लिए एक कदम दर कदम प्रक्रिया का वर्णन करता है।
Introduction
विकास के दौरान, सेल सेल संचार और बातचीत ऊतक और अंग संरचना और समारोह की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण हैं. कुछ मामलों में, इन सेल सेल बातचीत उचित अंग समारोह सुनिश्चित करने के लिए आसपास के वातावरण से अंगों को बंद कर देते हैं। यह तंत्रिका तंत्र के लिए मामला है, जो रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबी) द्वारा अछूता है। मनुष्यों में BBB के रोग मिर्गी सहित तंत्रिका संबंधी विकारों से जोड़ा गया है, और बाधा के टूटने एकाधिक काठिन्य और amyotrophic पार्श्व काठिन्य1सहित neurodegenerative रोगों में मनाया गया है. स्तनधारियों में बीबीबी एंडोथेलियल कोशिकाओं 2,3 के बीच तंग जंक्शनों द्वारा बनाई जातीहै। फल मक्खी, Drosophila मेलेनोगैस्टर सहित अन्य जानवरों, एक BBB glial कोशिकाओं से बना है. ये ग्लिल कोशिकाएं पोषक तत्वों, अपशिष्ट उत्पादों, विषाक्त पदार्थों, और तंत्रिका तंत्र4में और बाहर बड़े अणुओं की आवाजाही को नियंत्रित करने के लिए एक चुनिंदा पारगम्य बाधा बनाती हैं। यह कार्रवाई क्षमता आग करने के लिए आवश्यक विद्युत रासायनिक ढाल के रखरखाव के लिए अनुमति देता है, गतिशीलता और समन्वय के लिए अनुमति देताहै 4. डी मेलेनोगैस्टरमें, ग्लिया पोटेशियम समृद्ध, रक्त की तरह हीमोलिम्फ 5 से तंत्रिका तंत्र की रक्षा करताहै।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) और परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएनएस) में डी मेलेनोगैस्टर,दो बाहरी ग्लिल परतें, सबपेरिन्यूरियल ग्लिया और पेरिन्यूरियल ग्लिया, साथ ही अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स का बाहरी नेटवर्क, तंत्रिका पटलिका, फार्म हेमोलिम्फ मस्तिष्क और हेमोलिम्फ-नर्व बाधा6, इस लेख में BBB के रूप में संदर्भित. विकास के दौरान उपप्रगुणी ग्लिया बहुगुणित हो जाते हैं और तंत्रिका तंत्र को चारों ओर से घेर ने बढ़ा देते हैं5,6,7,8,9,10,11 . उपपरिप्रज्ञ ााली सेपट संधि है, जो हीमोलिम्फ तथा तंत्रिका तंत्र5,6,12के बीच मुख्य विसरण अवरोध प्रदान करता है. ये संधिएँ कशेरुकियों में मायलिनिंग ग्लिया के पैरानोडों में पाए जाने वाले पट-जैसे संधिओं के समान होती हैं, और वे स्तनधारियों के बीबी बी बी में तंग जंक्शनों के समान ही कार्य करते हैं13,14, 15 , 16 , 17. उप-पर्युदर्या के चारों ओर उप-पर्युदर्या के चारों ओर का विभाजन, वृद्धि और लपेटकर चयापचयों और बडेय अणुओं के प्रसार को विनियमित करने के लिए6,10,18,19. बीबीबी का निर्माण अंडे देने के 18.5 ज के बाद 25 डिग्री सेल्सियस5,8में पूरा हो जाता है । पिछले अध्ययनों में ऐसे जीनों की पहचान की गई है जो बीबीबी निर्माण20,21,22के महत्वपूर्ण विनियामक हैं . बेहतर इन जीनों की सटीक भूमिकाओं को समझने के लिए, यह BBB अखंडता पर इन संभावित नियामकों के उत्परिवर्तन के प्रभाव की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि पिछले अध्ययनों में भ्रूण और लार्वा में बीबीबी अखंडता को शामिल करने के दृष्टिकोण ों की रूपरेखा दी गई है , लेकिन इस परख के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल अभी तक5,7बताया गया है . यह चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल D. मेलेनोगैस्टर भ्रूणीय और तीसरे इनस्टार लार्वा चरणों के दौरान BBB अखंडता पर ाााालाएँ.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल डी मेलेनोगैस्टर विकास के देर से भ्रूण और तीसरे instar लार्वा चरणों के दौरान BBB अखंडता के लिए परख के लिए आवश्यक कदम का एक व्यापक विवरण प्रदान करता है. इसी तरह के दृष्टिकोणों का वर्णन विकास के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों इंजेक्शन के लिए उपकरणों के उपयोग के लिए डॉ एफ ब्रायन पिकेट और डॉ रोडनी डेल धन्यवाद. इस काम को लोयोला विश्वविद्यालय शिकागो से एमडी, डी.टी., और जे.जे.
Materials
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
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