Analysen for Blood-Brain Barrier integritet i Drosophila melanogaster
Summary
Blod-hjerne barriere integritet er avgjørende for nervesystemet funksjon. I Drosophila melanogasterdannes blod-hjerne-barrieren av gliacellene celler i løpet av sen embryogenesis. Denne protokollen beskriver metoder for å analysen for blod-hjerne barriere dannelse og vedlikehold i D. melanogaster embryo og tredje skikkelsen larver.
Abstract
Riktig nervesystemet utvikling omfatter dannelsen av blod-hjerne-barriere, diffusjon barriere som tett regulerer tilgang til nervesystemet og beskytter nevrale vev fra toksiner og patogener. Defekter i dannelsen av denne barrieren har blitt korrelert med nevropatier, og nedbryting av denne barrieren har blitt observert i mange nevrodegenerative sykdommer. Derfor er det avgjørende å identifisere gener som regulerer dannelse og vedlikehold av blod-hjerne barriere å identifisere potensielle terapeutiske mål. For å forstå den eksakte rollene disse genene spiller i neural utvikling, er det nødvendig å analysen effekten av endrede genuttrykk på integriteten av blod-hjerne barriere. Mange av molekylene som fungerer i etableringen av blod-hjerne-barrieren har blitt funnet å være bevart over eukaryote arter, inkludert frukten fly, Drosophila melanogaster. Frukt fluer har vist seg å være et utmerket modell system for å undersøke den molekylære mekanismer som regulerer nervesystemet utvikling og funksjon. Denne protokollen beskriver en trinnvis fremgangsmåte for å analysen for blod-hjerne barriere integritet under den embryonale og larvestadiet stadier av D. melanogaster utvikling.
Introduction
Under utvikling, celle-celle kommunikasjon og interaksjoner er avgjørende for etablering av vev og organ struktur og funksjon. I noen tilfeller, disse celle-celle interaksjoner forsegle organer fra omgivelsene for å sikre riktig organfunksjon. Dette er tilfelle for nervesystemet, som er isolert av blod-hjerne barriere (BBB). Dysfunksjon av BBB hos mennesker har vært knyttet til nevrologiske lidelser, inkludert epilepsi, og sammenbrudd av barrieren har blitt observert i nevrodegenerative sykdommer, inkludert multippel sklerose og amyotrofisk lateral sklerose1. I pattedyr, BBB er dannet av stramme veikryss mellom endothelial celler2,3. Andre dyr, inkludert frukten fly, Drosophila melanogaster, har en BBB sammensatt av gliacellene celler. Disse gliacellene cellene danner en selektivt gjennomtrengelig barriere for å kontrollere bevegelse av næringsstoffer, avfallsprodukter, toksiner, og store molekyler inn og ut av nervesystemet4. Dette gjør det mulig for vedlikehold av elektrokjemiske gradient nødvendig å brann handling potensialer, slik at for mobilitet og koordinering4. I D. melanogaster, glia beskytte nervesystemet fra kalium-rik, blod-lignende hemolymph5.
I det sentrale nervesystemet (CNS) og perifere nervesystemet (PNS) av D. melanogaster, to ytre gliacellene lag, subperineurial glia og perineurial glia, samt et ytre nettverk av ekstracellulære matrise, den nevrale lamella, danner hemolymph-hjerne og hemolymph-nerve barriere6, referert til som BBB gjennom denne artikkelen. Under utvikling subperineurial glia bli polyploid og forstørre å omgi nervesystemet5,6,7,8,9,10,11 . Den subperineurial glia form septate veikryss, som gir den viktigste diffusjon barriere mellom hemolymph og nervesystemet5,6,12. Disse knutepunktene er Molecularly lik den septate-lignende veikryss funnet på paranodes av myelinating glia i virveldyr, og de utfører samme funksjon som stramme veikryss i BBB av pattedyr13,14, 15 priser og , 16 flere , 17. perineurial glia dividere, vokse, og vikle rundt subperineurial glia å regulere spredningen av metabolitter og store molekyler6,10,18,19. BBB formasjon er fullført ved 18,5 h etter egglegging (AEL) ved 25 ° c5,8. Tidligere studier har identifisert gener som er kritiske regulatorer av BBB formasjon20,21,22. For bedre å forstå de eksakte rollene til disse genene, er det viktig å undersøke effekten av mutasjon av disse potensielle regulatorer på BBB integritet. Mens tidligere studier har skissert tilnærminger for assaying BBB integritet i embryo og larver, en omfattende protokoll for denne analysen har ennå ikke beskrevet5,7. Denne trinn-for-trinn protokollen beskriver metoder for assaying BBB integritet under D. melanogaster embryonale og tredje skikkelsen larvestadiet stadier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen gir en omfattende beskrivelse av trinnene som trengs for å analysen for BBB integritet i slutten av embryonale og tredje skikkelsen larvestadiet stadier av D. melanogaster utvikling. Lignende tilnærminger har blitt beskrevet andre steder for å analysen integriteten til BBB under utvikling, samt i voksen etapper5,7,29,30. Men beskrivelser av prosedyrer i materialer …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. F. Bryan Pickett og Dr. Rodney Dale for bruk av utstyr til injeksjon. Dette arbeidet ble finansiert av forskningsmidler fra Loyola University Chicago til MD, D.T., og JJ
Materials
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
References
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
- Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209 (4), 493-506 (2015).
- Hindle, S. J., Bainton, R. J. Barrier mechanisms in the Drosophila blood-brain barrier. Frontiers in Neuroscience. 8, 414 (2014).
- Schwabe, T., Bainton, R. J., Fetter, R. D., Heberlein, U., Gaul, U. GPCR signaling is required for blood-brain barrier formation in drosophila. Cell. 123 (1), 133-144 (2005).
- Stork, T., et al. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. Journal of Neuroscience. 28 (3), 587-597 (2008).
- Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Polyploidization of glia in neural development links tissue growth to blood-brain barrier integrity. Genes & Development. 26 (1), 31-36 (2012).
- Schwabe, T., Li, X., Gaul, U. Dynamic analysis of the mesenchymal-epithelial transition of blood-brain barrier forming glia in Drosophila. Biology Open. 6 (2), 232-243 (2017).
- Von Stetina, J. R., Frawley, L. E., Unhavaithaya, Y., Orr-Weaver, T. L. Variant cell cycles regulated by Notch signaling control cell size and ensure a functional blood-brain barrier. Development. 145 (3), dev157115 (2018).
- von Hilchen, C. M., Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Technau, G. M., Altenhein, B. Identity, origin, and migration of peripheral glial cells in the Drosophila embryo. Mechanisms of Development. 125 (3-4), 337-352 (2008).
- Beckervordersandforth, R. M., Rickert, C., Altenhein, B., Technau, G. M. Subtypes of glial cells in the Drosophila embryonic ventral nerve cord as related to lineage and gene expression. Mechanisms of Development. 125 (5-6), 542-557 (2008).
- Bellen, H. J., Lu, Y., Beckstead, R., Bhat, M. A. Neurexin IV, caspr and paranodin–novel members of the neurexin family: encounters of axons and glia. Trends in Neurosciences. 21 (10), 444-449 (1998).
- Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
- Banerjee, S., Pillai, A. M., Paik, R., Li, J., Bhat, M. A. Axonal ensheathment and septate junction formation in the peripheral nervous system of Drosophila. Journal of Neuroscience. 26 (12), 3319-3329 (2006).
- Bhat, M. A., et al. Axon-glia interactions and the domain organization of myelinated axons requires neurexin IV/Caspr/Paranodin. Neuron. 30 (2), 369-383 (2001).
- Faivre-Sarrailh, C., et al. Drosophila contactin, a homolog of vertebrate contactin, is required for septate junction organization and paracellular barrier function. Development. 131 (20), 4931-4942 (2004).
- Salzer, J. L., Brophy, P. J., Peles, E. Molecular domains of myelinated axons in the peripheral nervous system. Glia. 56 (14), 1532-1540 (2008).
- von Hilchen, C. M., Bustos, A. E., Giangrande, A., Technau, G. M., Altenhein, B. Predetermined embryonic glial cells form the distinct glial sheaths of the Drosophila peripheral nervous system. Development. 140 (17), 3657-3668 (2013).
- Matzat, T., et al. Axonal wrapping in the Drosophila PNS is controlled by glia-derived neuregulin homolog Vein. Development. 142 (7), 1336-1345 (2015).
- Limmer, S., Weiler, A., Volkenhoff, A., Babatz, F., Klambt, C. The Drosophila blood-brain barrier: development and function of a glial endothelium. Frontiers in Neuroscience. 8, 365 (2014).
- Ho, T. Y., et al. Expressional Profiling of Carpet Glia in the Developing Drosophila Eye Reveals Its Molecular Signature of Morphology Regulators. Frontiers in Neuroscience. 13, 244 (2019).
- DeSalvo, M. K., et al. The Drosophila surface glia transcriptome: evolutionary conserved blood-brain barrier processes. Frontiers in Neuroscience. 8, 346 (2014).
- . BDSC Cornmeal Food Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html (2017)
- Le, T., et al. A new family of Drosophila balancer chromosomes with a w- dfd-GMR yellow fluorescent protein marker. 유전학. 174 (4), 2255-2257 (2006).
- Casso, D., Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 88 (2), 229-232 (1999).
- Halfon, M. S., et al. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34 (1-2), 135-138 (2002).
- Miller, D. F., Holtzman, S. L., Kaufman, T. C. Customized microinjection glass capillary needles for P-element transformations in Drosophila melanogaster. BioTechniques. 33 (2), 366-372 (2002).
- Luong, D., Perez, L., Jemc, J. C. Identification of raw as a regulator of glial development. PLoS One. 13 (5), e0198161 (2018).
- Pinsonneault, R. L., Mayer, N., Mayer, F., Tegegn, N., Bainton, R. J. Novel models for studying the blood-brain and blood-eye barriers in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 686, 357-369 (2011).
- Love, C. R., Dauwalder, B., Barichello, T. Drosophila as a Model to Study the Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. , 175-185 (2019).
- Lin, D. M., Goodman, C. S. Ectopic and increased expression of Fasciclin II alters motoneuron growth cone guidance. Neuron. 13 (3), 507-523 (1994).
- Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone. 발생학. 238 (1), 47-63 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Devraj, K., Guerit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments. 132, e57038 (2018).
- Fairchild, M. J., Smendziuk, C. M., Tanentzapf, G. A somatic permeability barrier around the germline is essential for Drosophila spermatogenesis. Development. 142 (2), 268-281 (2015).
