Blod-hjärnbarriären integritet är avgörande för nervsystemets funktion. I Drosophila melanogasterbildas blod-hjärnbarriären av glialceller under sen embryogenes. Detta protokoll beskriver metoder för att analys för blod-hjärnbarriären bildning och underhåll i D. melanogaster embryon och tredje INSTAR larver.
Korrekt nervsystemet utveckling omfattar bildandet av den Blood-brain barriären, diffusions barriären som tätt reglerar tillgång till nervsystemet och skyddar nervvävnad från toxiner och patogener. Defekter i bildandet av denna barriär har korrelerats med neuropatier, och nedbrytningen av denna barriär har observerats i många neurodegenerativa sjukdomar. Därför är det viktigt att identifiera de gener som reglerar bildandet och underhållet av blod-hjärnbarriären för att identifiera potentiella terapeutiska mål. För att förstå de exakta rollerna dessa gener spelar i neurala utveckling, är det nödvändigt att analysen effekterna av förändrade genuttryck på integriteten av blod-hjärnbarriären. Många av de molekyler som fungerar i upprättandet av blod-hjärnbarriären har visat sig vara bevaras över eukaryota arter, inklusive bananfluga, Drosophila melanogaster. Fruktflugor har visat sig vara ett utmärkt modellsystem för att undersöka de molekylära mekanismerna som reglerar nervsystemets utveckling och funktion. Detta protokoll beskriver ett steg-för-steg-förfarande för att assay för blod-hjärnbarriären integritet under embryonala och larvstadier av D. melanogaster utveckling.
Under utveckling, cell-cellkommunikation och interaktioner är avgörande för inrättandet av vävnad och organ struktur och funktion. I vissa fall, dessa cell-cell interaktioner tätning av organ från den omgivande miljön för att säkerställa korrekt organfunktion. Detta är fallet för nervsystemet, som isoleras av blod-hjärnbarriären (BBB). Dysfunktion av BBB hos människor har kopplats till neurologiska sjukdomar inklusive epilepsi, och nedbrytning av barriären har observerats i neurodegenerativa sjukdomar inklusive multipel skleros och amyotrofisk lateral skleros1. Hos däggdjur bildas BBB genom täta korsningar mellan endotelceller2,3. Andra djur, inklusive bananfluga, Drosophila melanogaster, har en BBB består av gliaceller. Dessa gliaceller celler bildar en selektivt permeabel barriär för att kontrollera rörligheten för näringsämnen, slaggprodukter, toxiner, och stora molekyler in i och ut ur nervsystemet4. Detta möjliggör underhåll av den elektrokemiska lutning som krävs för att avfyra actionpotentialer, möjliggör rörlighet och samordning4. I D. melanogasterskyddar glia nervsystemet från den kalium rika, blodliknande hemolymfa5.
I centralanervsystemet (CNS) och perifera nervsystemet (PNS) av D. melanogaster, två yttre glialskikt, subperineurial glia och perineurial glia, samt ett yttre nätverk av extracellulär matris, den neurala lamellerna, bildar den hemolymfa-hjärna och hemolymfa-nerv barriär6, kallad BBB hela denna artikel. Under utveckling subperineurial glia bli polyploida och förstora för att omge nervsystemet5,6,7,8,9,10,11 . Subperineurial glia bildar septate korsningar, som ger den huvudsakliga diffusion barriären mellan hemolymfa och nervsystemet5,6,12. Dessa korsningar är molekylärt liknar septate-liknande korsningar finns på paranodes av myelinating glia i ryggradsdjur, och de utför samma funktion som täta korsningar i BBB av däggdjur13,14, 15 , 16 , 17. den perineurial glia dividera, växa, och Linda runt subperineurial glia att reglera spridningen av metaboliter och stora molekyler6,10,18,19. BBB-bildningen är avslutad med 18,5 h efter äggläggningen (AEL) vid 25 ° c5,8. Tidigare studier har identifierat gener som är kritiska regulatorer av BBB-formation20,21,22. För att bättre förstå de exakta rollerna för dessa gener, är det viktigt att undersöka effekten av mutation av dessa potentiella tillsynsmyndigheter på BBB integritet. Medan tidigare studier har skisserat metoder för testmetoder BBB integritet i embryon och larver, ett omfattande protokoll för denna analys har ännu inte beskrivits5,7. Detta steg-för-steg-protokoll beskriver metoder för testmetoder BBB integritet under D. melanogaster embryonala och tredje INSTAR larvstadier.
Detta protokoll ger en omfattande beskrivning av de steg som behövs för att assay för BBB integritet under sena embryonala och tredje INSTAR larvstadier av D. melanogaster utveckling. Liknande metoder har beskrivits på andra ställen för att assay integriteten av BBB under utveckling, samt i vuxen stadier5,7,29,30. Beskrivningar av procedurer i material-och metod avsnitt är dock …
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Dr. F. Bryan Pickett och Dr Rodney Dale för användning av utrustning för injektion. Detta arbete finansierades genom forskningsfinansiering från Loyola University Chicago till MD, D.T., och J.J.
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
Active Dry Yeast | Red Star | ||
Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 X .01mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
Light Source | Schott | Ace I | |
Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |