Analys av hematopoietisk stamcells metabolism
Summary
Hematopoietiska Stem progenitorceller (HSPCs) övergång från en quiescent tillstånd till en differentiering stat på grund av deras metaboliska plasticitet under blodbildningen. Här presenterar vi en optimerad metod för att mäta mitokondriell andning och glykolys av HSPCs.
Abstract
Hematopoietiska Stem progenitorceller (HSPCs) har distinkta metabolisk plasticitet, som tillåter dem att övergå från deras quiescent tillstånd till en differentiering tillstånd att upprätthålla kraven på blodbildningen. Emellertid, det har varit svårt att analysera den metabola status (mitokondriell andning och glykolys) av HSPCs på grund av deras begränsade antal och brist på optimerade protokoll för icke-anhängare, bräckliga HSPCs. Här ger vi en uppsättning tydliga, steg-för-steg-instruktioner för att mäta metabolisk andning (syreförbrukning hastighet; OCR) och glykolys (extracellulär syrnings hastighet; ECAR) av murina benmärg-LineagenegSca1+c-kit+ (LSK) hspcs. Detta protokoll ger en högre mängd LSK HSPCs från murina benmärg, förbättrar livskraften hos HSPCs under inkubering, underlättar extracellulära Flux analyser av icke-anhängare HSPCs, och ger optimerade injektion protokoll (koncentration och tid) för läkemedel riktade mot oxidativ fosforylering och glykolytiska vägar. Denna metod möjliggör förutsägelse av metabolisk status och hälsa HSPCs under blod utveckling och sjukdomar.
Introduction
Eftersom livslängden på de flesta mogna blodkroppar är kort, homeostas av blod förlitar sig på självförnyelse och differentiering av en långlivat men sällsynt population av hematopoietiska stamceller (HSPCs)1. HSPCs är quiescent, men de är snabba att förgöra och genomgå differentiering vid stimulering för att upprätthålla kraven i blodsystemet. Eftersom varje HSPC cellulära tillstånd kräver en unik bioenergetisk efterfrågan, de metabola förändringarna är viktiga drivkrafter för HSPC öde beslut. Därför, förlusten av metabolisk plasticitet, genom att förändra balansen mellan quiescence, självförnyelse, och differentiering av HSPCs, leder ofta till myelo-eller Lympho-proliferativa sjukdomar. Tillsammans är förståelsen av metabolisk reglering av HSPC utveckling avgörande för att avslöja mekanismerna bakom hematologiska maligniteter2,3,4,5.
Mitokondriell andning och glykolys generera ATP att driva intracellulära reaktioner och producera de byggstenar som behövs för makromolekyl syntes. Eftersom hspcs har låg mitokondriell massa jämfört med differentierade celler6 och de upprätthåller vilo i hypoxisk benmärgs nischer, hspcs främst förlita sig på glykolys. Aktivering av hspcs ökar deras mitokondriella metabolism som leder till förlust av vilo och deras efterföljande inträde i cellcykeln. Sådan metabolisk plasticitet av hspcs gör det möjligt att upprätthålla HSPC pool hela vuxenlivet6,7,8,9,10,11,12. Därför är det viktigt att undersöka deras metaboliska aktiviteter, såsom syre förbruknings graden (OCR, index för oxidativ fosforylering) och den extracellulära försurnings graden (ECAR; index för glykolys) för att analysera aktiveringen av HSPC och hälsostatusen. Både OCR och ECAR kan mätas samtidigt, i realtid, med hjälp av en extracellulär Flux Analyzer. Den aktuella metoden kräver dock ett stort antal celler och är optimerad för anhängare av celler13. Eftersom HSPCs inte kan isoleras i stora mängder från möss14, kräver sortering för att få en ren population, är icke-anhängare celler15, och kan inte odlas över natten utan att undvika differentiering16, har det varit svårt att mäta OCR och ECAR av hspcs. Här ger vi en uppsättning tydliga, steg-för-steg-instruktioner för att följa video-baserade tutorials om hur man mäter metabolisk andning och glykolys av några tusen murina benmärg-LineagenegSca1+c-kit+ (LSK) hspcs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här visar vi isolering av en maximal mängd ren och livskraftig murint LSK HSPCs befolkning samt mätning av deras glykolys och mitokondriell andning med en extracellulär Flux Analyzer. Protokollet övervinner särskilt följande tekniska frågor för användning av LSK HSPCs: i) den låga frekvensen av LSK HSPCs i murin benmärg14, II) låg basal metabolisk aktivitet av LSK hspcs26, III) bräckligheten av LSK hspcs27, och IV) att LSK hspcs inte ha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds delvis av finansieringsstödet från National Institutes of Health (HL131645, CA016058), St. Baldrick ‘ s Foundation och Pelotonia Foundation.
Materials
| 0.01% (w/v) poly-L-lysine solution | Sigma | P8920 | Used for LSK attachment |
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used for cell filtration after bone crushing |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Used for Lin- separation |
| Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Used for Lin- separation |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Used for LSK sorting |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Used for LSK sorting |
| Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001-HI | Used in FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Used for ficoll gradient separation |
| L-glutamine 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Used for the assay media |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Used for Lin- separation |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Used for LSK sorting |
| Murine Stem Cell Factor (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Used for the assay media |
| Murine Thrombopoietin (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Used for the assay media |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Used for FACS buffer |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Used for the assay media |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | P1304MP | Used for LSK sorting |
| Seahorse XFp Cell Culture Miniplate | Agilent Technologies | 103025-100 | Used for LSK seeding |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Used for the assay media |
| Streptavidin eFluor 450 Conjugate | eBioscience | 48-4317-82 | Used for LSK sorting |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Used for cartridge equilibration |
| XF media | Agilent Technologies | 103575-100 | Used for the assay media |
| XFp Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103017100 | Drugs for glycolysis stress test |
| XFp Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103010100 | Drugs for mitochondrial stress test |
| XFp Sensor Cartridge | Agilent Technologies | 103022-100 | Used for glycolysis and mitochondrial stress test |
References
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
- Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
- Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
- Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
- Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
- Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
- Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
- Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
- Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
- Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
- Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
- Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
- Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
- Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
- Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
- Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
- Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family–role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
- Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
- Fosslien, E. Mitochondrial medicine–molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
- Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
- Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
- Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
- Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
- Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
