Cell type-spesifikke Gene Expression profilering i musen Liver
Summary
Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) muliggjør rask og effektiv isolering av celle type-spesifikke oversette mRNA. Her viser vi en metode som kombinerer hydrodynamisk hale-blodåre injeksjon i en mus modell av leveren Repopulation og TRAP å undersøke uttrykket profilen til repopulating hepatocytter.
Abstract
Liver Repopulation etter skade er en viktig funksjon av pattedyr som hindrer umiddelbar organ svikt og død etter eksponering av miljøgifter. En dypere forståelse av endringene i genuttrykk som oppstår under Repopulation kan bidra til å identifisere terapeutiske mål for å fremme restaurering av leverfunksjon i innstillingen av skader. Likevel, metoder for å isolere spesielt de repopulating hepatocytter er hemmet av mangel på celle markører, begrenset celle tall, og skjørhet av disse cellene. Utviklingen av oversette ribosom affinitet rensing (Trap) teknologi i forbindelse med Fah-/- Mouse modell for å recapitulate Repopulation i innstillingen av leverskade tillater genuttrykk profilering av repopulating hepatocytter. Med TRAP, celle type-spesifikke oversette mRNA er raskt og effektivt isolert. Vi utviklet en metode som utnytter TRAP med affinitet-baserte isolering av oversette mRNA fra hepatocytter som selektivt uttrykker det grønne fluorescerende proteinet (GFP)-Tagged ribosomal protein (RP), GFP: RPL10A. TRAP omgår den lange tidsperioden som kreves for fluorescens celle sortering som kan endre gen uttrykks profilen. Videre, siden bare repopulating hepatocytter uttrykke GFP: RPL10A Fusion protein, den isolerte mRNA er blottet for forurensning fra omkringliggende skadde hepatocytter og andre celletyper i leveren. Affinitet-renset mRNA er av høy kvalitet og tillater nedstrøms PCR-eller høy-gjennomstrømning sekvensering-basert analyse av genuttrykk.
Introduction
Som de viktigste metabolske organ i virveldyr, leveren er ansvarlig for glukose homeostase, serum proteinsyntese, galle syre sekresjon, og xenobiotic oval metabolisme og avgiftning. Leveren besitter en ekstraordinær evne til å regenerere den skadde parenchyma upon eksponering for giftstoffer for å hindre umiddelbar leversvikt1. Imidlertid kan svikt i regenerering oppstå i innstillingen av paracetamol eller alkohol overforbruk, som kan føre til akutt leversvikt2. Videre, kronisk leverskader forårsaket av viral hepatitt infeksjon, fatty leversykdom, og steatohepatitis kan forårsake leveren fibrose, skrumplever, og leverkreft3. Den eneste tilgjengelige helbredende behandlingen for sluttfasen leversykdom er transplantasjon, men er begrenset av organ mangel, og forhindrer effektiv behandling for alle pasienter4. En bedre forståelse av gjenopprettingsprosessen etter giftig leverskade er derfor avgjørende for utvikling av behandlinger for å stimulere regenerering tilstrekkelig til å redde funksjon i det syke orgelet.
Den mest omfattende anvendt modell system for studiet av leveren gjenfødelse er delvis hepatectomy i gnagere, der en stor andel av leveren er resected å stimulere rask hepatocytter ekspansjon5. Men, delvis hepatectomy ikke recapitulate hepatocytter ekspansjon etter giftig leverskade på grunn av mangel på immun celle infiltrasjon og hepatocytter celle nekrose ofte observert i innstillingen av akutt leverskade hos mennesker6. Et mer egnet system for å modellere denne formen for orgel fornyelse er Fah-/- mus, som mangler funksjonell fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) kreves for riktig tyrosin metabolisme og utvikler alvorlig leverskader fører til død7. Disse musene kan opprettholdes i en sunn tilstand på ubestemt tid ved behandling med stoffet nitisinone i drikkevannet. Alternativt kan FAH uttrykk gjenopprettes ved transgene levering til en undergruppe av hepatocytter, som vil utvide til gjenbefolke leveren ved nitisinone fjerning8.
Å profil genuttrykk endringer av repopulating hepatocytter, et verktøy for å spesifikt isolere replikere hepatocytter i Fah-/- mus uten forurensning fra nabolandet skadde hepatocytter og andre celletyper er nødvendig. Dessverre er fluorescens-assistert celle sortering (FACS) av hepatocytter vanskelig siden (1) skjørhet av repopulating hepatocytter fører til dårlig restitusjon etter leveren, (2) replikere hepatocytter er svært variabel i størrelse, noe som gjør isolasjon av en ren befolkning av FACS vanskelig, og (3) prosedyren tid fra leveren til RNA isolasjon er større enn 2 h, derav genuttrykk profiler kan gjennomgå betydelige kunstige endringer før prøvene er ervervet9.
Alternativt, uttrykk for epitope-merket ribosomer spesielt i repopulating hepatocytter tillater rask isolering av aktivt oversette mRNA bundet av ribosomer ved hjelp av affinitet rensing umiddelbart etter orgel innhøsting, med bulk lever vev lysater. Her beskriver vi en protokoll for å utføre oversette-ribosom affinitet rensing (TRAP)10 etterfulgt av høy gjennomstrømming RNA-SEKVENSERING (Trap-SEQ), til spesielt isolere og profil mRNA i repopulating hepatocytter i Fah-/- mus9. Coexpression av grønne fluorescerende protein-merket ribosomal protein (GFP: RPL10A) med FAH tillater affinitet rensing av oversette mRNA bundet av polysomes som inneholder GFP: RPL10A. Denne metoden unngår alle celle dissosiasjon trinn, for eksempel lever-og repopulating hepatocytter. I stedet utnytter det lyse av hele orgel vev og antistoffer for å raskt trekke ut RNA spesielt fra målet cellene. Til slutt, isolering av rikelig, høy kvalitet mRNA via TRAP-SEQ muliggjør nedstrøms applikasjoner som sekvensering analyse til profilen den dynamiske endringen av genet uttrykk under Repopulation prosessen.
Protocol
Representative Results
Discussion
FELLE-SEQ er en teknikk for cellen type-spesifikk isolasjon av oversette mRNA via epitope-merket ribosomer og gaver en alternativ å FACS tilnærmelser, for den omgår begrensninger som tid behov av FACS9. I stedet tillater TRAP rask og effektiv isolering av RNA direkte fra masse vev, noe som bidrar til å unngå eventuelle endringer i genuttrykk. Trap-SEQ er spesielt velegnet for bruk i repopulating Fah-/- mus leveren, som hepatocytter ekspansjon etter fjerning av nitisinone …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) og P30-DK050306 (pilot stipend til KJW).
Materials
| 10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated | DWK Life Sciences (Wheaton) | 358007 | |
| Absolutely RNA Miniprep Kit | Agilent | 400800 | |
| Anti-GFP antibodies | Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core | GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7 | |
| Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cycloheximide | Millipore Sigma | C7698 | |
| Deoxycholic acid, DOC | Millipore Sigma | D2510 | |
| D-Glucose, Dextrose | Fisher Scientific | D16 | |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D9779 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Thermo Fisher Scientific | 65602 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific | Thermo Fisher Scientific | AAJ16924AE | |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Millipore Sigma | M8266 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | VV-83061-00 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England BioLabs | E7490S | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7530S | |
| Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 | Millipore Sigma | I8896 | |
| Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated | Ambion | AM9932 | |
| Overhead Stirrer | DWK Life Sciences (Wheaton) | 903475 | |
| PBS Buffer (10x), pH 7.4 | Ambion | AM9625 | |
| Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | 29997 | |
| Potassium chloride, KCl | Millipore Sigma | P4504 | |
| RNA 6000 Pico Kit & Reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2515 | |
| Sodium azide, NaN3 | Millipore Sigma | S2002 | |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | Millipore Sigma | S6297 | |
| SUPERase·In RNase Inhibitor | Invitrogen | AM2694 | |
References
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
- Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
- Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).
- Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).
- Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).
- Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Agilent Technologies. . Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , (2016).
- NEBNext. . NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , (2018).
- NanoDrop. . 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , (2009).
- Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).
- Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).
- Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. , (2019).
- Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. , (2019).
- Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
- Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).
- Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).
- Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
- Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets–a Promise Not yet Fulfilled?. Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).
