एक्स-रे गणना टोमोग्राफी के लिए डिज़ाइन किया गया एक्स-रे विशिष्ट धुंधला विधि का उपयोग करके सूक्ष्म ऊतक संरचनाओं के 3 डी दृश्य के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है।
हम एक विशिष्ट एक्स-रे दाग के साथ एक्स-रे माइक्रोसीटी और नैनोसीटी के संयोजन वाली प्रयोगशाला-आधारित विधि प्रदर्शित करते हैं, जो सेल कोशिकाद्रव्य को लक्षित करता है। वर्णित प्रोटोकॉल लागू करने के लिए आसान है, तेजी से और बड़ा नरम ऊतक नमूने के लिए उपयुक्त. प्रस्तुत पद्धति तीन आयामों में महत्वपूर्ण ऊतक संरचनाओं की विशेषता सक्षम बनाता है और एक पूरे माउस गुर्दे पर प्रदर्शन किया है. multiscale दृष्टिकोण पूरे माउस गुर्दे छवि के लिए अनुमति देता है और ब्याज की आगे की मात्रा है, जो नैनोमीटर रेंज में लेकर उच्च संकल्प के साथ प्राप्त कर रहे हैं के चयन का समर्थन करता है. इस प्रकार, इसी हिस्टोलॉजिकल प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियों के रूप में एक समान विस्तार स्तर के साथ नरम ऊतक आकृति विज्ञान पुनरुत्पादित है। ऊतक संरचनाओं के 3 डी विन्यास में गहरी अंतर्दृष्टि हिस्टोलॉजिकल तरीकों के माध्यम से आगे की जांच impeding बिना हासिल कर रहे हैं.
नरम ऊतक नमूनों की पूर्ण विशेषता 3 डी ऊतक microstructure के बारे में जानकारी की आवश्यकता है. नरम ऊतक नमूना विश्लेषण के लिए वर्तमान सोने के मानक हिस्टोपैथोलॉजी है. नमूने के ऊतक और सेलुलर आकारिकी का पता ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी 1 का उपयोग करके ब्याज (आरओआई) के चयनित क्षेत्रों के भीतर 2 डी में लगाया जाताहै। इस विधि, तथापि, कई कमियां हैं. नमूने की तैयारी समय लेने वाली, जटिल, विनाशकारी और कलाकृतियों के लिए प्रवण है। उत्पादित सूक्ष्म स्लाइड अनुभागिंग विमान के समानांतर केवल 2 डी जानकारी प्रदान करते हैं। प्रायः हिस्टोलॉजिकल खंडों की संख्या, जिसकी जांच की जाती है , समय की कमी2,3के कारण प्रतिबंधित होती है .
हाल के वर्षों में, 3 डी ऊतक विज्ञान के क्षेत्र में विकसित किया गया है. यहाँ, किसी भी वांछित स्थानिक विमान से आभासी ऊतक स्लाइस सुलभ हैं. यह नमूना भर में संरचनाओं की ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है, जो 3 डी ऊतक वास्तुकला और विभिन्न रोगों के साथ जुड़े संरचनात्मक परिवर्तन की गहरी समझ की ओर जाता है. 3 डी मात्रा डेटा के उत्पादन को प्राप्त करने के लिए विभिन्न तरीकों को विकसित किया गया है। वे सीरियल-सेक्शन आधारित दृष्टिकोणों से लेकर हैं, जो या तो प्रकाश या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी4,5,6,7,8, ब्लॉक-फ़ेस इमेजिंग विधियों, जैसे एपिस्कोपिक 3 डी इमेजिंग का उपयोग करते हैं। या ब्लॉक चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी7,8,9. तथापि, उल्लिखित सभी विधियों में या तो अनुभागीकरण शामिल है या नमूने को पूरी तरह से नष्ट कर दिया जाता है, जो आगे की जांच की अनुमति नहीं देता है। प्राप्त संकल्प पारंपरिक ऊतक विज्ञान में वर्णित के रूप में कलाकृतियों के लिए प्रवण किया जा रहा अनुभागिंग प्रक्रिया पर अत्यधिक निर्भर है। इन तरीकों संरेखण कलाकृतियों से भी पीड़ित हैं.
3 डी एक्स-रे इमेजिंग तकनीक जैसे सूक्ष्म और नैनोस्कोपिक गणना टोमोग्राफी (माइक्रोसीटी और नैनोसीटी) ऊतक नमूने के विनाश के बिना 3 डी उच्च-रिज़ॉल्यूशन डेटा उत्पन्न करने की ख्वाहिश है। अब तक, नरम ऊतक के कमजोर एक्स-रे क्षीणन विपरीत और एक प्रयोगशाला वातावरण में उच्च संकल्प करने के लिए सीमित उपयोग सूक्ष्म ऊतक संरचनाओं के 3 डी दृश्य के लिए उनके उपयोग बिगड़ा हुआ है. प्रयोगशाला आधारित, उच्च संकल्प एक्स-रे सीटी की ओर हाल ही में अग्रिम संकल्प के लिए अच्छी तरह से नीचे की अनुमति 1 $m10,11,12,13.
पारंपरिक क्षीणन-आधारित एक्स-रे इमेजिंग में नरम ऊतक में इसके विपरीत की कमी को धुंधला एजेंटों द्वारा मुआवजा दिया जाता है, जो एक्स-रे क्षीणन इसके विपरीत को बढ़ाता है। अन्य इमेजिंग तकनीकों जैसे ओस्मियम टेत्रोक्साइड (ओसो4), आयोडीन पोटेशियम आयोडाइड (आईकेआई) या फॉस्फोटंगस्टिक एसिड (पीटीए) से जाने जाने वाले दागदार एजेंटों का अक्सर14,15,16,17, का उपयोग किया जाता है, 18,19,20,21,22,23,24,25. दाग एजेंट जो (i) विशिष्ट जैविक लक्ष्यीकरण की अनुमति देते हैं, (ii) समरूप और पूर्ण धुंधला, (iii) आसान हैंडलिंग, (iv) प्रसार के छल्ले, (अ) बड़े और घने ऊतक धुंधला, और (vi) जैसे कलाकृतियों को बनाने के बिना ऊतक की तेजी से प्रवेश हिस्टोपैथोलॉजी के साथ पूर्ण संगतता सूक्ष्म ऊतक संरचनाओं के 3 डी दृश्य के लिए उपकरण के रूप में एक्स-रे सीटी स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं। इस काम में, हम बताते हैं कि कैसे नरम ऊतक नमूने एक्स-रे सीटी इमेजिंग के लिए तैयार कर रहे हैं एक कोशिका द्रव्य विशेष एक्स-रे eosin पर आधारित दाग है कि26से ऊपर उल्लिखित आवश्यकताओं को पूरा के साथ.
multiscale इमेजिंग दृष्टिकोण एक सिंहावलोकन microCT माप और आगे उच्च संकल्प जांच के लिए ब्याज की मात्रा (VOIs) के चयन के माध्यम से धुंधला गुणवत्ता का आकलन सुनिश्चित करता है. दाग गुणवत्ता का विश्लेषण दाग मानकों पर ध्यान केंद्रित करते हुए किया जाता है जैसे (i) पूर्णता, (ii) प्रसार के छल्ले की उपस्थिति, (पप) इसके विपरीत वृद्धि, (पअ) सीटी कलाकृतियों की उपस्थिति जैसे कि धारियाँ और (अ) एकरूपता। प्रयोगशाला आधारित नैनोसीटी सेटअप, जो ज्यामितीय आवर्धन का उपयोग करता है 100 एनएम तक संकल्प तक पहुंचने के लिए, (उप) -सेल्यूलर स्तर10,27पर नरम ऊतक आकृति विज्ञान की कल्पना करता है। इसी हिस्टोलॉजिकल प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवियों के साथ नैनोसीटी स्लाइस का एक तुलनात्मक विश्लेषण 2 डी में एक सूक्ष्म स्तर पर इसी तरह के विस्तार के साथ ऊतक वास्तुकला के प्रजनन की पुष्टि करता है, जिससे ऊतक के हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषता को सक्षम किया जा सकता है नमूना. इस विस्तृत वीडियो प्रोटोकॉल के लिए जागरूकता बढ़ाने के लिए और गैर विनाशकारी 3 डी नरम ऊतक इमेजिंग उपकरण के रूप में इस पद्धति की क्षमता को उजागर करने का इरादा है एक व्यापक वैज्ञानिक समुदाय के लिए ब्याज की जा रही है जैसे कि जीव विज्ञानियों, जीवविज्ञानियों और स्वास्थ्य पेशेवरों.
वर्तमान में, eosin सेल कोशिकाद्रव्य लेबल करने के लिए मानक हिस्टोलॉजिकल प्रोटोकॉल के रूप में प्रयोग किया जाता है। दागएजेंट को 0.1% (w/v) के रूप में लागू किया जाता है, जो कोमल ऊतक के सूक्ष्म स्लाइसों के लिए जलीय समाधान (आमतौर पर 2-10 डिग्री मी की मोटाई के साथ काटा जाता है)33. इस मानकीकृत हिस्टोलॉजिकल प्रोटोकॉल के आवेदन 3 डी ऊतक के नमूने के लिए इस तरह के एक पूरे माउस गुर्दे के रूप में एक क्षीणन इसके विपरीत बढ़ाया सीटी छवि में परिणाम नहीं है. एक तरफ, यह आम तौर पर प्रयोगशाला आधारित microCT प्रणालियों के एक्स-रे ऊर्जा के लिए नरम ऊतक के कम आंतरिक क्षीणन गुणों के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. आमतौर पर, नरम ऊतक मुख्य रूप से कार्बन, हाइड्रोजन, ऑक्सीजन और नाइट्रोजन34से बना है, और इसलिए, इसके विपरीत वृद्धि में परिणाम नहीं है. दूसरी ओर, धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया eosin की कम एकाग्रता सीमित कारक था. यद्यपि एक ईओसिन अणु में चार ब्रोमाइड परमाणु (उच्च परमाणु संख्या तत्व ब्रोमीन के साथ र् 3534) होते हैं, फिर भी एक्स-रे सीटी इमेजिंग के लिए आवश्यक संवेदनशीलता स्तर पूरे नहीं हुए।
कम क्षीणता विपरीत की इस चुनौती पर काबू पाने के लिए, eosin के कई सांद्रता की जांच की गई. एक सीमा यहाँ पानी में eosin की अधिकतम घुलनशीलता है, जो एक जलीय समाधान में 30% (w/v) है. नरम ऊतक के भीतर सबसे अच्छा क्षीणन विपरीत वृद्धि उच्चतम eosin एकाग्रता, जो Lambert-बीयर कानून के अनुसार की उम्मीद थी के साथ मनाया गया था. इसलिए, अंतिम धुंधला प्रोटोकॉल उच्चतम एकाग्रता के साथ किया गया था.
सवाल कैसे आगे इसके विपरीत वृद्धि में सुधार करने के लिए धुंधला प्रक्रिया के लिए एक आणविक स्तर पर बेहतर नरम ऊतक तैयार करने के लिए पीएच समायोजन द्वारा उत्तर दिया गया था. यहाँ, निर्धारण के दौरान या धुंधला करने से पहले नरम ऊतक नमूने का अम्लीकरण महत्वपूर्ण पाया गया. यह भी हांगकांग एट अल35द्वारा दिखाया गया था. एसिड द्वारा सेल साइटोप्लाज्म के भीतर धुंधला एजेंट के उच्च संचय बेहतर आयनिक बातचीत के माध्यम से प्राप्त किया गया था, जो सेल साइटोप्लाज्म के भीतर मौजूद प्रोटीन और पेप्टाइड्स के एमिनो एसिड साइड चेन के प्रोटोन का परिणाम था। एक गैर-सगाहुआ नरम ऊतक नमूने की तुलना में इसके विपरीत वृद्धि को हाइलाइट करने वाला एक प्रतिनिधि परिणाम चित्र 1a,bमें दिखाया गया है। यहाँ, एक पूरे माउस गुर्दे का एक संरचनात्मक अवलोकन प्रांतस्था, मेडुला, पपीला और गुर्दे श्रोणि जैसे महत्वपूर्ण शारीरिक क्षेत्रों visualizing हासिल किया गया था.
प्रस्तुत धुंधला प्रोटोकॉल लागू करने के लिए सरल है और केवल तीन कदम शामिल हैं. आवश्यक अभिकर्मकों को आसानी से पहुँचा जा सकता है. 24 घंटे के समग्र धुंधला समय एक पूरे अंग धुंधला के लिए तेजी से है, जो नरम ऊतक नमूने के 3 डी दृश्य सक्षम बनाता है (चित्र 1ग, चित्र 2ख और चित्रा 4ख) पर एक प्रयोगशाला वातावरण में सेलुलर स्तर के लिए नीचे कई तराजू. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि समग्र धुंधला समय और धुंधला समाधान की मात्रा की जरूरत नमूने की प्रकृति के आधार पर कुछ रूपांतरों का अनुरोध हो सकता है. फिर भी, eosin आधारित धुंधला प्रोटोकॉल पूरे अंग धुंधला है, जो तब पूरे अंगों के उच्च संकल्प microCT इमेजिंग सक्षम बनाता है के लिए उपयुक्त है. विलायक इथेनॉल, जो microCT माप के दौरान नमूना नम रखने के लिए इस्तेमाल किया गया था के कारण हटना कलाकृतियों, नहीं देखा गया. अतिरिक्त तैयारी कदम नैनोसीटी इमेजिंग के लिए आवश्यक हैं, जो मूल नमूने से प्राप्त छोटे ऊतक टुकड़ों की जांच के लिए अनुमति देता है। भविष्य के हिस्टोपैथोलॉजिकल अनुप्रयोगों के संबंध में, अवलोकन स्कैन परिवर्तित शारीरिक क्षेत्रों और संरचनाओं में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा, जो ROIsके निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं जैसा कि चित्र 2एमें दिखाया गया है। इनका अध्ययन माइक्रोसीटी द्वारा 3डी में किया जा सकता है (चित्र 1ग और चित्र 2ख) या नैनोसीटी ( चित्र4ख) और 2डी में ऊतक विज्ञान के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है ( चित्र3) .
प्रोटोकॉल की एक और ताकत एच एंड ई धुंधला प्रक्रिया के संबंध में हिस्टोपैथोलॉजी के साथ पूर्ण संगतता में देखा जाता है। थोक नमूनों के लिए eosin आधारित धुंधला प्रक्रिया के आवेदन आगे हिस्टोलॉजिकल जांच में बाधा नहीं है (चित्र 3),भले ही लागू eosin एकाग्रता हिस्टोलॉजिकल धुंधला समाधान की तुलना में बहुत अधिक है. लगभग 400 दउ की आभासी मोटाई के साथ नैनोसीटी स्लाइस (चित्र 3क) पहले से ही हिस्टोलॉजिकल सेक्शन(चित्र 3ग)से बहुत अच्छी तरह तुलना करता है , जो संगत नरम ऊतक नमूने से प्राप्त किया गया था। 7-10 डिग्री के साथ एक हिस्टोलॉजिकल अनुभाग की अनुमानित मोटाई को ध्यान में रखते हुए, नैनोसीटी डेटा के न्यूनतम तीव्रता प्रक्षेपण स्लाइस की पीढ़ी (चित्र 3ख),जो लगभग 7 डिग्री मी की आभासी मोटाई के अनुरूप है, एक के लिए अनुमति देता है हिस्टोलॉजिकल अनुभाग के साथ बेहतर तुलना (चित्र 3ग) यहाँ, कोशिका नाभिक स्पष्ट रूप से गैर क्षीणन क्षेत्र के रूप में प्रकट कर रहे हैं के रूप में eosin विशेष रूप से दाग प्रोटीन और पेप्टाइड्स सेल कोशिका द्रव्य33में.
मानक हिस्टोलॉजिकल तरीकों के साथ आगे काउंटर धुंधला के आवेदन संभव है, भले ही मानक हिस्टोलॉजिकल धुंधला प्रक्रिया की तुलना में धुंधला के आदेश उलट गया था. सीटी के लिए विकसित eosin आधारित धुंधला प्रोटोकॉल के साथ पहले शुरू, hematoxylin के साथ उन eosin आधारित हिस्टोलॉजिकल वर्गों के काउंटर धुंधला द्वारा पीछा, पूर्ण संगतता के लिए अनुमति देता है और एक उच्च गुणवत्ता वाले दाग में परिणाम की उम्मीद फार्म प्रदर्शित उपस्थिति की. मेयर के खट्टे हेमेटॉक्सिलिन के साथ सेल नाभिक-विशिष्ट दाग को हिस्टोलॉजिकल अनुभाग पर लगाया गया था जिसमें कोशिका नाभिक को बैंगनी में हाइलाइट किया गया था (चित्र 3घ)। हिस्टोलॉजिकल काउंटर धुंधला के आवेदन वर्तमान में एच दाग तक ही सीमित है. अन्य मानक हिस्टोलॉजिकल काउंटर stainings जैसे आवधिक एसिड Schiff आधार, लोचिका वैन Gieson या गोमोरी चांदी के रूप में अच्छी तरह से इम्यूनोहिस्टोलॉजिकल तकनीकों के साथ संगतता के रूप में मूल्यांकन किया जाना है परीक्षण करने की जरूरत है.
eosin आधारित धुंधला प्रोटोकॉल के लिए अनुमति देता है (i) सेल कोशिका द्रव्य-विशिष्ट लक्ष्यीकरण, (ii) समरूप और पूर्ण धुंधला, (iii) आसान कार्यान्वयन, (iv) इस तरह के प्रसार के छल्ले के रूप में कलाकृतियों बनाने के बिना ऊतक के तेजी से प्रवेश, (v) के दाग बड़े और घने नरम ऊतक नमूने, और (vi) एच एंड ई दाग के संबंध में हिस्टोपैथोलॉजी के साथ पूर्ण संगतता. इन आवश्यकताओं को सेलुलर स्तर के नीचे नरम ऊतक के उच्च संकल्प एक्स-रे सीटी दृश्य की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण हैं। हाल ही में विकसित नैनोसीटी उपकरणों के साथ संयोजन में12,36,37, आभासी हिस्टोलॉजिकल स्लाइस की विनाशकारी पीढ़ी जो पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल डेटा के विपरीत और संकल्प में तुलनीय हैं संभव प्रदान की जाती है. इस संयुक्त दृष्टिकोण सूक्ष्म ऊतक संरचनाओं के 3 डी दृश्य के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में एक्स-रे सीटी की स्थापना में सक्षम हो जाएगा।
The authors have nothing to disclose.
हम हिस्टोलॉजिकल चर्चा और Excillum एबी, स्वीडन में अत्यंत उपयोगी टीम के लिए डॉ एनकेन Drecoll धन्यवाद। हम उन्नत फोटोनिक्स (एमएपी) और DFG Gottfried Wilhelm Leibniz कार्यक्रम के लिए उत्कृष्टता म्यूनिख केंद्र के DFG क्लस्टर के माध्यम से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं. इसके अलावा, इस अनुसंधान परियोजना को यूरोपीय संघ क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से मैरी स्कोडोस्का-क्यूरी अनुदान समझौते के तहत धन प्राप्त हुआ है। H2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.
50-ml centrifuge tube by Falcon | VWR | 734-0453 | |
Formaldehyde solution, 37% | Carl Roth | CP10.2 | acid-free, stabilized with ~10% MeOH |
Glacial acetic acid | Alfa Aesar | 36289.AP | |
Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | certified by Biological Stain Commission |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium |
Sample Tubes by Nalgene | Carl Roth | ATK5.1 | |
Rocking Shaker ST5 | CAT | 60281-0000 | |
Cellulose tissue paper | VWR | 115-0600 | |
Forceps, by USBECK Laborgeräte | VWR | 232-0096 | |
Microcentrifuge tubes by Eppendorf | VWR | 211-2120 | safe-lock, 2.0 ml |
Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
Disposable safety scalpel by Aesculap | VWR | AESCBA210 | |
Petri dish by Sterilin | VWR | 391-2019 | |
Plastic pasteur pipette | Carl Roth | EA68.1 | graduated, 1 ml |
Desiccator by Duran | VWR | SCOT247826954 | |
Silicone grease by Bayer | Sigma-Aldrich | 85404 | high-vacuum |
Carbon dioxide cylinder with standpipe | Linde | 3700113 | 10 kg, short |
micro-porous treatment capsule | PLANO GmbH | 4614 | pore size 78 µm (B) |
Bal-Tec CPD 030 | Bal-Tec AG | CO2 as drying agent | |
Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD | Zeiss | this stereomicroscope has been updated(1) | |
Zeiss Xradia Versa 500 | Zeiss | this microCT scanner has been updated(2) | |
Avizo Fire 8.1 | Thermo Fisher Scientific | ||
PILATUS detector as part of the nanoCT scanner | Dectris | single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7) | |
nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner | Excillum | high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7) | |
(1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019). | |||
(2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019). | |||
(3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015). | |||
(4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009). | |||
(5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009). | |||
(6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019). | |||
(7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019). |