Live Cell Imaging zur Bewertung der Dynamik von Metaphasen-Timing und Zellschicksal nach mitotischen Spindelstörungen
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der Dynamik der Spindelbildung und der mitotischen Progression vor. Unsere Anwendung der Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht es dem Anwender, Zellen in verschiedenen Stadien der Mitose zu identifizieren, mitotische Defekte zu verfolgen und zu identifizieren und die Spindeldynamik und das mitotische Zellschicksal bei Exposition gegenüber Anti-Mitotik-Medikamenten zu analysieren.
Abstract
Live-Zell-Zeitraffer-Bildgebung ist ein wichtiges Werkzeug in der Zellbiologie, das Einblicke in zelluläre Prozesse bietet, die andernfalls von der Fixed-Cell-Analyse übersehen, missverstanden oder falsch interpretiert werden könnten. Während die fixe Zellbildgebung und -analyse robust und ausreichend ist, um den zellulären Stationären Zustand zu beobachten, kann sie bei der Definition einer zeitlichen Reihenfolge der Ereignisse auf zellulärer Ebene eingeschränkt sein und ist schlecht gerüstet, um die transiente Natur dynamischer Prozesse einschließlich mitotische Progression. Im Gegensatz dazu ist die Live-Zell-Bildgebung ein eloquentes Werkzeug, das verwendet werden kann, um zelluläre Prozesse auf einzelzelliger Ebene im Laufe der Zeit zu beobachten, und hat die Fähigkeit, die Dynamik von Prozessen zu erfassen, die sonst in der Bildgebung fester Zellen schlecht dargestellt wären. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Erzeugung von Zellen, die fluoreszierend markierte Marker von Chromatin und Mikrotubuli tragen, und deren Verwendung in Live-Zell-Bildgebungsansätzen zur Überwachung der Metaphasenchromosomausrichtung und des mitotischen Austritts. Wir beschreiben bildgebende Techniken zur Beurteilung der Dynamik der Spindelbildung und der mitotischen Progression, einschließlich der Identifizierung von Zellen in verschiedenen Stadien der Mitose, der Identifizierung und Verfolgung von mitotischen Defekten und der Analyse der Spindeldynamik und mitotischezellliche semittizische Zellschicksale nach der Behandlung mit mitotischen Inhibitoren.
Introduction
Die bildbasierte Analyse fester Zellen wird häufig verwendet, um die Veränderungen der Zellpopulationsebene als Reaktion auf verschiedene Störungen zu bewerten. In Kombination mit der Zellsynchronisierung, gefolgt von der Erfassung und Abbildung von seriellen Zeitpunkten, können solche Ansätze verwendet werden, um eine zelluläre Abfolge von Ereignissen vorzuschlagen. Dennoch ist die Bildgebung fester Zellen insofern begrenzt, als zeitliche Beziehungen für eine Population impliziert und nicht auf der Ebene einzelner Zellen nachgewiesen werden. Auf diese Weise reicht die Bildgebung und Analyse fester Zellen zwar aus, um robuste Phänotypen und stationäre Veränderungen zu beobachten, aber die Fähigkeit, vorübergehende Veränderungen im Laufe der Zeit zu erkennen und Veränderungen, die sich nur auf eine Teilpopulation der Zellen auswirken, ist unvollkommen. Im Gegensatz dazu ist die Live-Zell-Bildgebung ein eloquentes Werkzeug, das verwendet werden kann, um zelluläre und subzelluläre Prozesse innerhalb einer einzelnen Zelle oder Zellpopulation im Laufe der Zeit und ohne die Hilfe von Synchronisationsansätzen zu beobachten, die sich selbst auf das zelluläre Verhalten auswirken können. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.
Die Bildung einer bipolaren mitotischen Spindel ist für die richtige Chromosomensegregation während der Zellteilung unerlässlich, was zu zwei genetisch identischen Tochterzellen führt. Defekte in der mitotischen Spindelstruktur, die die mitotische Progression korrumpieren und die Genauigkeit der Chromosomensegregation beeinträchtigen, können zu katastrophalen Zellteilungen und einer verminderten Zelllebensfähigkeit führen. Aus diesem Grund sind mitotische Gifte, die die Spindelbildung verändern, vielversprechende Therapeutika, um die schnelle Proliferation von Krebszellen7,8,9zu begrenzen. Dennoch ist die feste Zellanalyse der Spindelstruktur nach Zugabe von mitotischen Giften in ihrer Fähigkeit, den dynamischen Prozess der Spindelbildung zu beurteilen, begrenzt und kann nicht darauf hinweisen, ob beobachtete Veränderungen der Spindelstruktur dauerhaft sind oder stattdessen vorübergehend und kann überwunden werden, um eine erfolgreiche Zellteilung zu ermöglichen.
In diesem Protokoll beschreiben wir einen Ansatz zur Bewertung der Dynamik der Mitose nach Spindelstörungen durch Live-Zell-Bildgebung. Mit der hTERT verewigten RPE-1-Zelllinie, die entwickelt wurde, um ein Mit dem RFP-markiertes Histone 2B auszudrücken, um Chromatin zusammen mit einem EGFP-getaggten -Tubulin zu visualisieren, um Mikrotubuli, das Timing der Metaphasenchromosomausrichtung, den Anaphasenbeginn und letztlich Das mitotische Zellschicksal wird anhand visueller Hinweise auf Chromosomenbewegung, Verdichtung und kerntechnische Morphologie beurteilt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die zeitliche Auflösung der Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung und Bewertung sequenzieller zellulärer Ereignisse innerhalb einzelner Zellen. Ansätze, die die zelluläre Synchronisierung nutzen, gefolgt von der Erfassung und Fixierung von Zellen zu sequenziellen Zeitpunkten, sind insofern begrenzt, als Vergleiche zwischen Gruppen von Zellen durchgeführt werden. In Kontexten, in denen die zelluläre Reaktion auf Störungen ungleichmäßig sein kann oder in denen der zu visualisierte Prozess dynamisch …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DLM wird von einem NSF-GRFP unterstützt. ALM wird durch fördermittelweise aus dem Smith Family Award for Excellence in Biomedical Research gefördert.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
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