Live cell Imaging att bedöma dynamiken i metafas timing och cell öde efter mitotiska spindel Perturbations
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma dynamiken i spindel bildning och mitotisk progression. Vår tillämpning av tidsförlopp Imaging gör det möjligt för användaren att identifiera celler i olika stadier av Mitos, spåra och identifiera mitotiska defekter, och analysera spindel dynamik och mitotiska cell öde vid exponering för anti-mitotiska läkemedel.
Abstract
Live cell Time-lapse Imaging är ett viktigt verktyg i cellbiologi som ger insikt i cellulära processer som annars kan förbises, missförstås eller misstolkas av den fasta cell analys. Medan den fasta cell avbildning och analys är robust och tillräcklig för att observera cellulära steady-state, kan det begränsas i att definiera en temporal ordning av händelser på cellnivå och är dåligt rustad för att bedöma den övergående karaktären av dynamiska processer, inklusive mitotisk progression. Däremot är Live cell Imaging ett vältaligt verktyg som kan användas för att observera cellulära processer på encelliga nivå över tid och har kapacitet att fånga dynamiken i processer som annars skulle vara dåligt representerade i fasta cell avbildning. Här beskriver vi en metod för att generera celler som transporterar Fluorescent märkta markörer för kromatin och mikrotubuli och deras användning i levande cell avbildning metoder för att övervaka metafas kromosom justering och mitotisk utgång. Vi beskriver Imaging-baserade tekniker för att bedöma dynamiken i spindel bildning och mitotisk progression, inklusive identifiering av celler i olika stadier i Mitos, identifiering och spårning av mitotiska defekter och analys av spindeldynamik och mitotiska cellers öde efter behandlingen med mitotiska hämmare.
Introduction
Bildbaserad analys av fasta celler används ofta för att bedöma förändringar i cell populations nivån som svar på olika störningar. I kombination med cellsynkronisering, följt av insamling och avbildning av seriella tidspunkter, kan sådana metoder användas för att föreslå en cellulär sekvens av händelser. Icke desto mindre, fast cell avbildning är begränsad i att temporala relationer är underförstått för en population och inte visas på nivån för enskilda celler. På detta sätt, medan fast cell avbildning och analys är tillräcklig för att iaktta robusta fenotyper och steady-state förändringar, förmågan att upptäcka övergående förändringar över tid och förändringar som påverkar endast en subpopulation av cellerna är ofullkomlig. I motsats, Live cell Imaging är ett vältaligt verktyg som kan användas för att observera cellulära och subcellulära processer inom en enda cell, eller cellulära befolkningen, över tid och utan hjälp av synkroniseringsmetoder som själva kan påverka cellulära beteende 1 , 2 , 3 , 4 , ,5 , 6.
Bildandet av en bipolär mitotisk spindel är avgörande för korrekt kromosom segregering under celldelningen, vilket resulterar i två genetiskt identiska dotterceller. Defekter i mitotisk spindel struktur som korrupt mitotisk progression och äventyra trohet av kromosom segregering kan resultera i katastrofala celldelningar och minskad cell lönsamhet. Av denna anledning, mitotiska gifter som förändrar spindel bildning är lovande Therapeutics att begränsa den snabba spridningen av cancerceller7,8,9. Icke desto mindre, fast cell analys av spindel struktur efter tillsats av mitotiska gifter är begränsad i sin förmåga att bedöma den dynamiska processen av spindel bildning och kan inte indikera om observerade förändringar i spindel struktur är permanenta eller är i stället övergående och kan övervinnas för att möjliggöra framgångsrik celldelning.
I detta protokoll beskriver vi en metod för att bedöma dynamiken i Mitos efter spindel störningar genom levande cell avbildning. Använda hTERT förevigat RPE-1 cellinjer konstruerade för att uttrycka en RFP-märkt Histone 2B att visualisera kromatin, tillsammans med en EGFP-märkta α-tubulin att visualisera mikrotubuli, tidpunkten för metafas kromosom justering, Anaphasen debut, och i slutändan mitotiska cellers öde bedöms med hjälp av visuella ledtrådar av kromosom rörelse, kompakaktion och nukleär morfologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den temporala upplösningen som tillhandahålls av Time-lapse Imaging möjliggör visualisering och bedömning av sekventiella cellulära händelser inom enskilda celler. Metoder som utnyttjar cellulär synkronisering följt av insamling och fixering av celler vid sekventiella tidpunkter är begränsade i att jämförelser i slutändan görs mellan populationer av celler. I sammanhang där cellulära svar på störningar kan vara icke-enhetliga, eller där den process som visualiseras är dynamisk, Live cell Time-lapse I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DLM stöds av en NSF GRFP. ALM stöds av finansiering från Smith Family Award för excellens inom biomedicinsk forskning.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibo-Life sciences | 25-510 | A serine protease used to release adherent cells from culture dishes |
| 15ml centrifuge tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| 20x CFI Plan Fluor objective | Nikon | For use in Live-cell imaging to visualize both bright field and fluorescence | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | For use in retroviral transfection; used in step 1.1 |
| a-tubulin-EGFP | Addgene | various numbers | Expression vector for alpha tubulin fused to a green fluorescent protein tag; for use in the visualization of tubulin in live-cell imaging: commercially available through addgene and other vendors |
| Alisertib | Selleckchem | S1133 | Small molecule inhibitor of the mitotic kinase Aurora A. Stock concentration is prepared at 10mM in DMSO, and used at a final concentration of 100nM. |
| Blasticidin | Invitrogen | A11139-03 | Antibiotic selection agent; used to select for a-tub-EGFP expressing cells |
| C02 | Airgas | For use in cell culture and live cell imaging | |
| Chroma ET-DS Red (TRITC/Cy3) | Chroma | 49005 | Single band filter set; excitation wavelength 545nm with 25nm bandwidth and emission at 605nm wavelength with 70nm bandwidth; for visualization of H2B-RFP |
| Chroma ET-EGFP (FITC/Cy2) | Chroma | 49002 | Single band filter set; excitation wavelength 470nm with 40nm bandwidth and emission at 525nm wavelength with 50nm bandwidth; for visualization of GFP-tubulin |
| disposable glass Pastuer pipets, sterilized | Fisher Scientific | 13-678-6A | For use in aspirating cells |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibo-Life sciences | 11965-084 | Cell culture medium for growth of RPE-1 and 293T cells |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibo-Life sciences | 10438-026 | Cell culture medium supplement |
| Lipofectamine 3000 and p3000 | Invitrogen | L3000-015 | Lipid based transfection reagent for transfection of plasmids; used in 1.1.4 |
| Multi well Tissue Culture dishes | Corning | various | for use in cell culture, transfection/infection, and live cell imaging |
| Nikon Ti-E microscope | Nikon | Inverted epifluorescence microscope for use in live-cell imaging | |
| NIS Elements HC | Nikon | Version 4.51 | Image acquisition and analysis software; used in sections 3 & 4 |
| OPTI-MEM | Gibo-Life sciences | 31985-070 | Reduced serum medium for cell transfection; used in step 1.1.3 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibo-Life sciences | 15140-122 | antibiotic used in cell culture medium |
| phosphate bufferred saline (PBS) | Caisson labs | PBP06-10X1LT | sterile saline solution for use with cell culture |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | Lentiviral VSV-G envelope expression construct; used in step 1.1.4 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Cationic polymer used to enhane viral infection efficiency; used in step 1.1.10 |
| psPAX | Addgene | 12260 | 2nd generation lentiviral packaging plasmid; used in step 1.1.4 |
| Puromycin | Invitrogen | ant-pr-1 | Antibiotic selection agent; used to select for RFP-H2B expressing cells |
| RFP- Histone 2B (H2B) | Addgene | various numbers | Expression vector for red fluorescent protein-tagged histone 2B; for use in the visualization of chromatin in live-cell imaging: commercially available through Addgene and other vendors |
| RNAi Max | Invitrogen | 13778-150 | Lipid based transfection reagent for transfection of siRNA constructs |
| RPE-1 cells | ATCC | CRL-4000 | Human retinal pigment epithelial cell line |
| Tissue culture dish 100x20mm | Corning | 353003 | for use in culturing adherent cells |
| Zyla sCMOS camera | Nikon | Camera attached to the micrscope, used for capturing images of cells |
References
- Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
- Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491 (2016).
- Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
- Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?. Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
- van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
- Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411 (2012).
- Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
- Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
- Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
- Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
- Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
- Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
- Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131 (2011).
- Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
- Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564 (2009).
- Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?. Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
- Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
